复方核黄素眼用即型凝胶的兔眼内药效学研究*

张玉琴，曾嵘，许敏

（中南大学湘雅医院 药学部，湖南 长沙 410008）

眼的生理结构存在泪液屏障、角膜屏障及血眼屏障，会导致药物在眼表流失迅速，常规滴眼液中药物在眼表的滞留时间只有几秒钟。生物利用度低，在目标区域难以获得最佳的有效药物浓度是眼科药物治疗的主要问题之一[1-3]。眼用即型凝胶是在20 世纪80年代提出的一种新剂型，由不同响应机制的高分子材料载药形成的一种滴眼剂，以滴眼液的形式入眼，在眼表受温度、离子浓度、pH 值等变化的影响而快速形成凝胶的一种眼用制剂[4-7]，兼具有滴眼液和凝胶剂的优点，给药剂量准确，眼表滞留时间长，药物流失少，生物利用度高，患者的舒适度和依从性都得到了改善[8-12]。

复方核黄素眼用即型凝胶的基础方是中南大学湘雅医院自制剂的复方核黄素滴眼液（原名角膜营养液），其主药成分核黄素对角结膜上皮细胞的发育和健康有重要作用，对不同原因造成的角膜损伤具有修复作用。针对复方核黄素滴眼液在眼表流失迅速、生物利用度低等不足，本研究将传统滴眼液通过剂型改良制备成复方核黄素即型凝胶，该即型凝胶外观澄清，透明，呈橘黄色，在室温下为溶液状，35℃下可发生胶凝，形成均匀、细腻的凝胶[8]。本研究从药物在眼表的滞留时间、对眼表的刺激性及对角膜损伤的疗效等方面对复方核黄素眼用即型凝胶的药效学进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与仪器

新西兰兔12只，体重2.5～3.0 kg（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：43608300000587）；钴蓝光笔（柯来视爱眼护眼中心）。

1.2 试剂和药品

眼用荧光素钠试纸（天津晶明新技术开发有限公司），生理盐水（科伦药业，250 ml，批号：20171121），氢氧化钠NaOH（国药集团，500 g，批号：20150706），盐酸利多卡因注射液（广东邦民制药厂有限公司，5 ml，批号：17020202），戊巴比妥钠（德国Merck 公司，5 g，批号：922IJD35），复方核黄素眼用即型凝胶（湘雅医院药学部实验室自制，5 ml，批号：20170701，核黄素磷酸钠含量：0.094%），复方核黄素滴眼液（湘雅医院药学部实验室自制，5 ml，批号：20170713，核黄素磷酸钠含量：0.097%）。

1.3 兔眼表滞留时间计算

将6 只2.5～3.0 kg 新西兰兔随机分为两组，每组3 只。每次取制备的复方核黄素即型凝胶或复方核黄素滴眼液1 滴，分别滴至荧光素钠试纸，蘸入兔眼表，采用秒表进行计时，在钴蓝笔照射下观察兔眼表荧光消失的时间[12-13]，重复3 次，取其均值。

1.4 兔眼表刺激性实验

选择5 只新西兰兔，各滴入1、2 滴所制备的眼用即型凝胶放入兔右眼的结膜囊中，使其上眼睑和下眼睑微闭几秒，以左眼为正常空白对照，采用眼刺激评分量表进行评分与分级[14]，见表1、2。考察单次给药后1、24、48 和72 h 的兔结膜、角膜、虹膜的损伤情况，以及2 次/d 给药后第7 和14 天即型凝胶对兔眼表的累积或持续损害。

表1 刺激性评分量表

续表1

表2 刺激性评分分级表

1.5 角膜损伤的疗效观察

将12 只新西兰兔随机分为复方核黄素眼用即型凝胶组（简称即型凝胶组）、复方核黄素滴眼液组（简称滴眼液组）和模型组。所有兔右眼均采用NaOH进行角膜损伤模型的复制，左眼做空白对照[8]，滴眼液组和即型凝胶组在模型复制后均采用相应的药物滴眼，1、2 滴/次，2 次/d，模型组模型复制后不进行处理。模型复制方法：首先采用3%戊巴比妥按1 mg/kg 体重耳缘静脉给药麻醉，1%利多卡因滴右眼，蘸取0.25 mol/L NaOH 置于兔右眼角膜涂抹均匀，30 s后用生理盐水冲洗[15-17]。模型复制后1 d 可肉眼观察到所有兔眼睑无明显损伤，部分兔结膜稍红肿，并通过荧光素染色检查符合《职业性化学性眼灼伤诊断标准》[14]轻度化学性眼灼伤特征。

在模型复制后第1、3、5 和7 天采用荧光素钠染色分别观察其眼表损伤恢复情况。采用荧光素钠试纸蘸取1 滴生理盐水，滴入兔眼结膜囊内，使其上下眼睑闭合几秒后睁开，用钴蓝光笔照射眼表，观察眼表着染，正常角膜无明显角膜着染荧光点，损伤角膜有着染，根据荧光素染色评分标准进行评分[13]。第7天将所有兔空气栓塞处死，取完整眼角膜组织，放入10%甲醛固定液中固定24 h，行HE 染色，观察角膜组织形态学变化。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.00 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用秩和检验或重复测量设计的方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔眼表滞留时间的比较

复方核黄素滴眼液的眼表平均滞留时间为（9.67±2.52）s，复方核黄素即型凝胶的眼表滞留时间为（306.00±33.30）s，经秩和检验,差异有统计学意义（单侧α=0.05，P=0.005），复方核黄素眼用即型凝胶的眼表滞留时间长于复方核黄素滴眼液。见表3。

表3 即型凝胶组与滴眼液组眼表滞留时间的比较 s

2.2 即型凝胶对无兔眼表刺激性

在用复方核黄素眼用即型凝胶单次滴眼后的1、24、48 和72h 及累积滴眼后的第7 和14 天观察即型凝胶对兔眼表的损伤情况。实验过程中眼刺激性得分均为0 分，即型凝胶滴眼后，兔角膜仍然透明，无浑浊，虹膜纹理清晰，无水肿，结膜无充血，无异常分泌物，结果提示，该即型凝胶对眼部无刺激。

2.3 角膜损伤的疗效比较

兔角膜损伤模型复制后1 d 可肉眼观察到所有兔眼睑无明显损伤，部分兔结膜稍红肿，并通过荧光素钠染色检查符合轻度化学性眼灼伤特征。即型凝胶组、滴眼液组与模型组在模型复制后的第1、3、5 和7 天的评分比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的荧光素钠染色评分有差异（F=19.41，P=0.000）。②3 组的荧光素钠染色评分有差异（F=81.67，P=0.001），第5 和第7 天即型凝胶组和滴眼液组比模型组的眼表荧光素钠评分低，相对愈合效果较好。③3 组的荧光素钠评分变化趋势有差异（F=19.15，P=0.000）（见表4）。第1 天即可观察到荧光素钠染色呈片状，得分最高，之后荧光素钠染色面积逐渐缩小，得分下降（见图1）。（正常角膜无明显角膜着染荧光点，左眼空白对照荧光素钠染色检查评分均为0，该组数据不需计入统计分析）。

表4 荧光素钠染色评分结果 （±s）

表4 荧光素钠染色评分结果 （±s）

注：†与同时间的模型组比较，P ＜0.05。

组别 第1 天 第3 天 第5 天 第7 天模型组 7.50±0.58 6.25±0.97 4.00±0.82 2.25±0.50即型凝胶组 7.25±0.96 4.75±1.26 2.25±0.96† 1.25±0.96†滴眼液组 7.50±1.30 5.00±1.83 2.00±0.82† 1.00±0.82†

图1 兔角膜荧光素钠染色结果

2.4 角膜损伤恢复的组织形态学变化

正常角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层构成。经HE 染色镜检正常角膜组织上皮细胞之间相邻紧密，细胞核完整，无明显空隙。基质层内胶原细胞排列整齐、规则，内皮细胞与基质层细胞之间连接紧密。而模型组角膜上皮细胞连接中断，细胞结构发生破坏，形成细胞缺失，基质层细胞排列较紊乱，细胞间隙增大，内皮细胞发生脱离。即型凝胶组角膜上皮层细胞中的翼状上皮细胞存在缺损，尚未完全恢复，基质层、内皮层完好。而滴眼液组可观察到上皮细胞中的基底细胞与基质细胞之间联系疏松，基质层和内皮层无明显变化（见图2）。结果提示，复方核黄素眼用即型凝胶和复方核黄素滴眼液对兔眼表碱损伤动物模型的角膜修复有促进作用。

图2 兔角膜HE 染色图

3 讨论

眼睛具有特殊的解剖和生理特性，它涉及不同的防御屏障，药物需要通过不同的防御屏障才到达眼内组织[18]。眼用经典剂型（溶液、混悬液或软膏）在角膜前区域滞留时间较短[2]，药物通过眼睑移动迅速从眼皮上去除，经鼻泪吸收至全身血液循环或通过结膜途径吸附到全身循环，只有不到3%～5%的药物被吸收进入眼内组织[19]，因此经典剂型局部给药生物利用度低。为提高药物在眼部的生物利用度，药剂学研制出如纳米粒、脂质体、树状大分子、植入物、隐形眼镜、纳米悬浮液、微针和即型凝胶等多种药物缓释系统来满足不同的临床需求[20-21]，提高眼部用药的疗效和患者的依从性。

即型凝胶给药系统是以液体状态存在，可用常规滴眼形式用药，滴眼后以液体形式进入眼睛，与角膜接触后形成不易流动的半固体凝胶[9]，可避免药物在角膜前迅速消除[23]，减少药物流失，延长药物在角膜前区域滞留时间，增加药物与作用部位接触的时间，提高其生物利用度，减少用药次数，使患者的舒适度和依从性也都得到了改善。文献报道即型凝胶可以提高影响眼睛表面和前段疾病的治疗效果，如青光眼，白内障，干眼病，葡萄膜炎，以及眼部微生物感染等[22]。

本研究的复方核黄素眼用即型凝胶是以核黄素为主药，泊洛沙姆407 和甲基纤维素为基质材料的温度敏感型眼用即型凝胶[8]，它在室温下呈现溶液状，在体温附近即发生溶液-凝胶转化，成为不能流动的半固体凝胶。本实验结果提示复方核黄素眼用即型凝胶在兔眼表刺激性实验中不具有刺激性。本研究复方核黄素眼用即型凝胶其眼表滞留时间比滴眼液的眼表滞留时间长，提示复方核黄素眼用即型凝胶具有很好的缓释作用，能延长药物的眼表滞留时间，提高其生物利用度。

本研究采用的复方核黄素眼用即型凝胶的主药核黄素能促进角结膜上皮细胞的发育和健康[24]，具有抗氧化，增强免疫、健康皮肤和毛发等功能[25]。本研究通过复制新西兰兔角膜损伤模型，使兔角膜呈现轻度损伤，角膜损伤部位荧光素钠眼表着染呈片状；在荧光素钠染色实验中，即型凝胶组和滴眼液组与模型组荧光素钠染色评分在术后第5 和7 天比较有统计学意义，表明复方核黄素眼用即型凝胶能加速角膜损伤的愈合。本研究结果表明在模型复制后第7 天，即型凝胶组角膜损伤比模型组轻，提示复方核黄素眼用即型凝胶能够促进模型兔的眼表碱损伤角膜修复，表明复方核黄素眼用即型凝胶和复方核黄素滴眼液对眼表碱损伤的动物模型具有促进角膜修复的效果。本文仅从药物滞留时间、对眼表刺激性和角膜损伤的疗效等方面进行考察，考察指标有限，未能全面反映复方核黄素滴眼液与复方核黄素眼用即型凝胶之间的疗效差异，有待后续进一步的研究。