保健食品中维生素B1、B2、B6和烟酰胺同时测定方法的改进

2020-10-07朱艳春王倩徐金玲

甘肃医药 2020年5期

朱艳春王倩徐金玲

河南省食品药品检验所，河南郑州450008

维生素B属于水溶性维生素，有调节新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统等功能，是人体内新陈代谢的必需一环。但我国仍未完善针对此类商品维生素B功效成分检测的相关标准，目前国标法测定食品中维生素B采用多种条件分别测定［7-10］。这些方法多数涉及复杂又费时的前处理，并不适用于基质相对简单的保健食品。文献中报道同时测定维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的检验方法也很多［1-6］，但在样品前处理及含量测定方法上与国标方法偏离［7］较大。

本研究对国标方法［7］进行改进，建立一种同时测定维生素B1、维生素B2、维生素B6（盐酸吡哆醇）和烟酰胺的方法，该方法简便、快速、准确、灵敏，维生素B1、维生素B2、维生素B6测定结果与其他国标法相比较，误差较小。烟酰胺仍采用国标方法，但由于在检测保健食品时常需要同时检测维生素B和烟酰胺成分，所以在本方法中一并提出同时测定。

1 仪器与试剂

1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司DAD检测器）；Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司FLD检测器）；KQ-300VDE型双频数控超声波（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER TOLEDO XPE205电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）。

1.2 试药达尔斯康牌B族维生素片（山东圣海保健品有限公司，批号BS201900012）；MCKIN麦金利RB族维生素片（武汉麦鑫利药业有限公司，批号BS2019000 18）；艾申特牌B族维生素片（东莞市健林医药科技有限公司，批号为BS201900032）。

维生素B1（硫胺素，纯度：97.9%，中国食品药品检定研究院，批号：100390-201806）；维生素B2（核黄素，纯度：98.2%，中国食品药品检定研究院，批号：100369-201504）；维生素B6（盐酸吡哆醇，纯度：99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批号：G154414）；烟酰胺（纯度：99.9%，中国食品药品检定研究院，批号：100115-201604）。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；检测器：二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）；流动相：0.005mol/L 1-癸烷磺酸钠0.1%磷酸：乙腈=73：27等度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：260nm、280nm；进样量：10μL。

2.2 溶液制备对照品溶液的配制：取维生素B1、维生素B2、维生素B6（盐酸吡哆醇）和烟酰胺对照品适量，精密称定，分别置于10mL、10mL、10mL、5mL容量瓶中，除维生素B2用1∶1盐酸溶解后，其余均用水定容至刻度，配制成维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺浓度为1.04mg/mL、1.07mg/mL、1.07mg/mL、2.18mg/mL的对照品储备液。分别吸取维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺对照品储备液0.3mL、0.2mL、0.2mL、0.4mL置于10mL容量瓶中，用20%甲醇0.1%磷酸水溶液定容至刻度，配制成混合对照品工作溶液。

2.3供试品溶液的配制取试样10片，研细，混合均匀，取达尔斯康牌B族维生素片1.0g；MCKIN麦金利B族维生素片0.5g；艾申特牌B族维生素片0.1g；精密称定。分别置于50mL容量瓶中，加入20%甲醇0.1%磷酸水溶液约40mL，超声提取10min，用20%甲醇0.1%磷酸水溶液定容至刻度，待用。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性试验。取2.2项下对照品工作溶液、供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1、图2。理论塔板数以维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺计均大于5000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

2.4.2 线性关系试验。分别取维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺对照品储备液各适量，用20%甲醇0.1%磷酸水稀释制备成系列混合标准工作溶液，取10μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X，mg/L），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的回归方程分别为：Y1=20.499X1-21.831，Y2=38.698 X2+3.6367，Y3=16.52X3-1.8424，Y4=1.6904X4+2.735（r＞0.9990）。结果表明，维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺质量浓度在10.4～62.6mg/L、5.2～41.7mg/L、5.4～6 4.4mg/L、54.5～152.6mg/L范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.3 精密度试验。取2.2项下混合对照品溶液适量，按拟定色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺保留时间稳定，峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为：0.09%，0.05%，0.11%，0.10%（n=6），表明仪器精密度好。

2.4.4 检出限试验。取混合对照品溶液逐级稀释，得维生素B1检出限：0.51mg/L、维生素B2检出限：0.051mg/L、维生素B6检出限：0.26mg/L和烟酰胺检出限：0.006mg/L。

2.4.5 加标回收试验。精密称取空白样品9份，分成3组，每组3份样品，置于25mL容量瓶中，按高、中、低三个浓度分别添加对照品后，照2.2项下方法制备供试品溶液，再按拟定色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算回收率。见表1。

2.4.6 样品含量测定。取3批样品各适量，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液再按拟定色谱条件进样测定，计算样品含量。对同样3批样品进行规定国标方法检测，计算样品含量，与本方法所得样品含量比较，结果相近。见表2。

图1 对照品色谱图

图2 样品色谱峰

表1 加标回收率试验结果

续表1

3 讨论

本试验着力建立一种能同时测定维生素B1、维生素B2、维生素B6和烟酰胺的简便有效方法，结合国标方法［7］，对提取溶剂（水、0.1%磷酸水、20%甲醇0.1%磷酸水）进行了考察，结果确定最优的提取溶剂为20%甲醇0.1%磷酸水。对流动相（十二烷基硫酸钠0.1%磷酸、癸烷磺酸钠0.1%磷酸、庚烷磺酸钠0.1%磷酸）等进行了预实验，结果各洗脱系统对峰形的影响均不大，但是考虑到色谱柱平衡稳定时间以及国标方法［7］前处理过程的一致性，故选择癸烷磺酸钠0.1%磷酸作为流动相。参考国标方法［7］的检测波长，分别在280nm和260nm处进行检验，结果显示260nm检测波长下测定维生素B1、维生素B2和烟酰胺，280nm检测波长下测定维生素B6响应最好。三个样品的检测结果分别与国标方法［7-10］的检验结果比较，其相对标准偏差均在允许范围内。本试验方法与国标方法［7］比较，用二极管阵列检测器比紫外检测器能更好地选择波长；多组分在同等条件下采用250nm的C18色谱柱比150nm的C18柱分离效果会更好，但出峰时间会推后，因此将柱温由室温调到35℃缩短出峰时间。均能满足一般含量检测要求。