氮掺杂碳量子点的制备及其在细胞成像与邻硝基苯酚检测中的应用

姜 丽，梁峻毅，王玉彤，鲍林春，吴 韵，郑玉国，夏光平，张小兰，张仟春*

(1.兴义民族师范学院 生物与化学学院，贵州 兴义 562400；2.贵州省化学合成及环境污染控制和修复技术特色重点实验室，贵州 兴义 562400；3.黔西南州人民医院 检验科，贵州 兴义 562400)

碳量子点(Carbon quantum dots,CQDs)因具有良好的水溶性、光学稳定性、出色的生物相容性、生物低毒性以及强荧光性能[1-4]，已在生物医学成像、分析物检测、荧光标记、催化剂、探针和光学元件等领域展现出良好的应用前景[5-7]。目前，大量学者研究了多种制备CQDs的方法，主要有水热法、化学氧化法、微波辅助法、电化学氧化法、激光刻蚀法和超声法等[4,6]。在众多的制备方法中，使用廉价和生态友好型生物质的水热法受到了广大研究者的青睐，该法合成简单、绿色环保、经济。前驱体的选择是制备CQDs的关键，直接影响量子产率、荧光强度及稳定性，是实际应用中提高选择性和灵敏度的重要因素。在CQDs的制备过程中通过原子掺杂(例如氮、磷、硼等)不仅可以提高CQDs的量子产率及荧光强度，还可在CQDs中提供活性位点，从而拓宽其在分析检测等领域的潜在应用[1,4,8]。氮外层有5个价电子且存在孤电子对，可提供多余的n电子，使费米能级上移从而改变光学性质，同时氮原子与碳原子大小相当，使得氮成为CQDs中的理想掺杂元素，拓宽了CQDs的应用范围[4]。因此，高含氮量的物质常作为CQDs前驱体进行研究。

邻硝基苯酚(o-Nitrophenol,o-NP)是酚类家族中的高剧毒物质，是环境分析优先监测的污染物，美国环境保护署已将其列为优先治理的对象[9]。因此，建立环境样品中o-NP的分析方法具有重要意义。目前，硝基苯酚的常用分析方法有光谱分析法[9]、毛细管电泳法[10]、流动注射分析法[11]、高效液相色谱法[12]、气相色谱-质谱法[13]和电化学分析法[14]等。这些方法大多操作繁琐、仪器价格昂贵、分析检测成本高。而荧光分光光度法由于操作简单，且具有良好的选择性、灵敏性以及使用成本低等优点，广泛用于物质的分析检测[15-16]。

L-瓜氨酸和尿素的含氮量分别为24%和47%，是理想的氮掺杂前驱体。本文首次以L-瓜氨酸和尿素为混合前驱体，采用水热法一步合成了氮掺杂碳量子点(N-CQDs)。对制备的N-CQDs进行表征，研究其发光特性和细胞毒性，并进一步用于细胞成像实验，证实该N-CQDs具有水溶性好、稳定性高、细胞毒性小、生物相容性好、荧光强度大和量子产率高的优点，具有潜在的应用价值。此外，基于o-NP对探针N-CQDs的选择性猝灭效应，以及o-NP浓度与N-CQDs荧光强度之间良好的线性关系，发展了一种简单、快速、灵敏的实际水样中o-NP的检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

L-瓜氨酸、尿素、硫酸奎宁、磷酸盐缓冲液(PBS)、对硝基苯酚(p-NP)、盐酸多巴胺(DA)、Zn(NO3)2·6H2O、AlCl3、Cu(NO3)2·3H2O、MgCl2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、CaCl2和1 000 μg/mL邻硝基苯酚(o-NP)标准溶液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；异丙醇、邻苯二酚(CC)和对苯二酚(HQ)购于百灵威科技有限公司；NaCl、KCl和Hg(NO3)2·H2O购于国药集团化学试剂有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和DMEM培养基购自北京索莱宝科技有限公司；实验所用试剂均为分析纯；HepG2细胞由黔西南州人民医院提供；实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

Hitachi-F20高分辨透射电子显微镜(HRTEM)；Bruker multimode 8原子力显微镜(AMF)；Leica SP8激光共聚焦扫描显微镜(德国韦茨拉尔徕卡)；Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR)、ESCALAB 250Xi型光电子能谱仪(XPS)、Multiskan FC酶联免疫检测仪(美国赛默飞世尔)；D8 X射线粉末衍射仪(XRD，德国Bruker公司)；RF-6000荧光分光光度计(日本岛津公司)；4501S紫外-可见光分光光度计(UV-Vis,天津港东科技发展股份有限公司)；KT7-900-434高速离心机(德国克恩达)；KQ5200DE数控超声波清洗器(中国昆山超声仪器有限公司)；AL104电子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 碳量子点的制备

称取一定质量比的L-瓜氨酸和尿素，加入20 mL超纯水，超声振荡20 min使其分散完全，将所配溶液转移至50 mL高压反应釜中，于180～240 ℃烘箱中反应6～14 h。反应结束后，取出反应釜，待其冷却至室温，将反应液超声分散30 min，于12 000 r/min超速离心20 min，以0.22 μm滤膜过滤后得到N-CQDs溶液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 氮掺杂碳量子点的细胞毒性及生物成像

通过标准MTT法进行HepG2细胞的毒性检测实验，具体操作如下：首先，在37 ℃，5% CO2条件下将HepG2细胞加入到96孔平地板中培养24 h，细胞密度为4×103/孔。然后将细胞培养基取出，每孔加入100 μL含有不同质量浓度N-CQDs(0～1 000 μg/mL)的DMEM培养基培养24 h，清洗细胞，向平地板中每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT继续培养4 h。随后吸去细胞培养基和MTT并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，加入异丙醇，于100 r/min振荡10 min，在450 nm波长的酶联免疫检测仪上测量每孔的光密度，计算细胞活性。

将100 μL含有10% PBS的新鲜DMEM和HepG2细胞(1×105/皿)加入培养皿中，于37 ℃，5% CO2条件下培养24 h后，加入N-CQDs溶液，继续培养2 h。用PBS溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)冲洗3次后，分别在488 nm和610 nm检测波长下成像。

1.4 邻硝基苯酚的检测

取20.0 μL N-CQDs溶液(25 mg/mL)于5 mL比色管中，以PBS(0.1 mol/L,pH 7.4)缓冲液定容，加入5.0 μL不同浓度的o-NP溶液，室温下反应30 min，于380 nm激发波长下扫描其荧光发射光谱。N-CQDs的荧光猝灭率为IF/IF0，IF0为无o-NP的N-CQDs溶液的荧光强度，IF为加入o-NP后的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 氮掺杂碳量子点的制备

为了获得最佳荧光强度的N-CQDs，考察了L-瓜氨酸和尿素两种前驱体的质量比及两者的质量浓度、制备温度和制备时间对N-CQDs荧光强度的影响。结果显示，当L-瓜氨酸与尿素质量比为3∶2时N-CQDs的荧光强度最佳(图1A)。且当L-瓜氨酸和尿素的质量浓度在6.25～25 mg/mL范围时，N-CQDs的荧光强度随质量浓度的增加而增大，并在25 mg/mL时达到最大值，此后随着前驱体质量浓度继续增大，N-CQDs的荧光强度反而降低(图1B)，这可能是由于较高浓度易引起N-CQDs聚集而导致荧光猝灭[17-18]所致。因此，选择两种前驱体的最佳质量浓度均为25 mg/mL。实验发现，N-CQDs的荧光强度随制备温度的升高而增强，并在240 ℃时达到最大值(图1C)，考虑到对位聚苯内胆反应釜的安全性，选择240 ℃作为制备的最佳温度；制备时间对N-CQDs荧光强度也有明显影响，制备时间为10 h时，荧光强度达到最大值(图1D)，因此选择10 h作为水热制备的最佳时间。故N-CQDs的最佳制备条件为：L-瓜氨酸与尿素的质量比与质量浓度分别为3∶2和25、25 mg/mL，制备温度为240 ℃，制备时间为10 h。

2.2 氮掺杂碳量子点的表征

通过HRTEM及AFM观察制备的N-CQDs的形貌。图2A显示，N-CQDs为近圆形且单分散性良好的纳米颗粒；其平均粒径在2.8 nm左右(图2A插图)。从图2B和图2C可以看出，该N-CQDs的平均高度约2.7 nm。以上结果表明，所制备的N-CQDs是一种近乎微观准球形的碳纳米颗粒[19]。图2D为N-CQDs的HRTEM图，图中显示该N-CQDs晶格条纹的晶面间距为0.25 nm，与石墨碳相符;N-CQDs在2θ=22°处的较宽的平缓衍射峰(图3A)对应于石墨碳的(002)晶面[20],证实其为无定形碳结构。

2.3 氮掺杂碳量子点的光致发光特性

通过三维荧光光谱测试了N-CQDs激发、发射吸收特征峰的大概范围，结果如图4A所示，其激发范围为300～450 nm，发射范围为350～550 nm。在350～390 nm波长激发下，其主要发射带集中在415～478 nm，对激发波长具有一定的依赖性，这可能是由共轭π域的发射以及表面缺陷所致[29]。采用UV-Vis和荧光分光光度计考察了N-CQDs的光学吸收特征(图4B)，该N-CQDs在290～600 nm范围内有较宽的紫外吸收峰(黑线)，可能是n-π*跃迁的结果[30]。该N-CQDs最佳的激发(蓝线)和发射(红线)波长分别为380 nm和453 nm。制备的N-CQDs溶液在日光下呈淡黄色，在365 nm紫外灯下，该N-CQDs发射出强烈的蓝色荧光(图4B插图)，当激发波长为380 nm时，在453 nm处出现最强荧光。以硫酸奎宁(0.1 mol/L H2SO4,QY=54%)为荧光标准物，测得N-CQDs的量子产率为39.2%。

2.4 氮掺杂碳量子点的稳定性

实验发现，采用尿素和L-瓜氨酸为前驱体制备的N-CQDs荧光强度比仅采用L-瓜氨酸制备的CQDs荧光强度高、稳定性好。且N-CQDs可在12 h内保持荧光强度基本不变，17 h后荧光仅减弱13.1%，不影响应用。

图5 pH值对N-CQDs荧光强度的影响Fig.5 Effect of pH value on the fluorescence intensity of N-CQDs

高酸碱性对N-CQDs具有明显影响，为了获得稳定的实际样品分析条件，考察了pH值对N-CQDs荧光强度的影响。发现在pH 4.0～8.0范围内，N-CQDs荧光强度变化较小，而在pH 1.0～4.0和pH>8.0时，荧光强度明显减小(图5)。因此，进行水样中o-NP的含量分析时，在pH 7.4条件下进行检测。

2.5 氮掺杂碳量子点的细胞毒性及生物成像

为了评估N-CQDs的细胞毒性，采用标准MTT法测定了用N-CQDs处理后HepG2细胞的活性。将HepG2细胞分别与不同剂量的N-CQDs培育24 h，当N-CQDs的质量浓度小于100 μg/mL时，细胞活性大于95%；N-CQDs质量浓度达1 000 μg/mL时，其细胞活性仍可达到85%。该结果表明所制备的N-CQDs具有较低的细胞毒性，可用于生物标记。为了进一步证实N-CQDs在细胞成像中应用的可行性，在37 ℃，5% CO2条件下，将HepG2细胞与质量浓度分别为50 μg/mL和250 μg/mL的N-CQDs共培育24 h，并使用荧光显微镜在488 nm和610 nm检测波长下进行观察。结果显示，在上述条件下细胞分别发出绿色(488 nm)和红色(610 nm)的荧光，且绿色荧光的成像效果最佳(图6)，同时经250 μg/mL N-CQDs培育后的HepG2细胞成像效果优于50 μg/mL N-CQDs培育后的成像效果。该结果表明N-CQDs具有良好的渗透性能和生物相容性，可作为生物体成像的探针使用。

图6 HepG2细胞和N-CQDs(0、50、 250 μg/mL)培育24 h的共聚焦荧光图像Fig.6 Confocal fluorescence images of HepG2 cells incubated with N-CQDs(0,50,250 μg/mL) for 24 h at two different excitation wavelengths including 488 nm(green) and 610 nm(red)

2.6 选择性

考察了水中常见的Fe3+、Zn2+、K+、Hg2+、Al3+、Mg2+、Ca2+、Na+、Cu2+、HQ、DA、p-NP、CC等干扰物对测定的影响。如图7所示，当上述金属离子及小分子与o-NP的浓度均为10 μmol/L时，各干扰物基本不影响o-NP的测定，说明N-CQDs荧光体系对o-NP具有良好的选择性。

图7 N-CQDs探针对o-NP的选择性Fig.7 Selectivity of N-CQDs sensing system to o-NPa-n：blank，Fe3+，Zn2+，K+，Hg2+，Al3+，Mg2+，Ca2+，Na+，Cu2+，HQ，DA，p-NP，CC

2.7 线性关系及检出限

考察了不同浓度o-NP对N-CQDs体系荧光强度的影响，结果显示，当o-NP浓度为0.083 3、0.333、0.666、1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.0、12.0、30.0、60.0、90.0、 120、150 μmol/L时，体系的荧光强度随o-NP浓度的增加逐渐降低，体系发生不同程度的荧光猝灭，且N-CQDs荧光猝灭程度与o-NP浓度(c)在0.083 3～12.0 μmol/L范围内呈良好线性关系，线性方程为IF/IF0=0.0128 8c+1.027 16,r2=0.998，检出限(S/N=3)为25.2 nmol/L，低于美国国家环境保护署的标准19.4 μmol/L[31]，且低于先前一些关于o-NP检测文献的报道(表1)，表明该N-CQDs可用于地表水样中o-NP的检测。

2.8 实际样品测定

采集贵州省兴义市万峰湖景区湖水和顶效河河水样品，经12 000 r/min转速离心后，以0.22 μm滤膜滤除杂质，采用本方法测定，结果如表2所示。本方法测定o-NP的回收率为85.2%～112%，相对标准偏差为2.8%～3.7%。结果表明，本方法具有较好的准确性，可用于实际样品中o-NP含量的检测。

表1 本方法与其他o-NP测定方法的比较Table 1 Comparison of the proposed method with other reports for o-NP determination

表2 实际样品中邻硝基苯酚的测定(n=3)Table 2 Detection of o-nitrophenol in real samples(n=3)

3 结 论

本研究以L-瓜氨酸和尿素为前驱体，通过水热法一步合成了分散性良好、球形规则、尺寸均一、平均粒径为2.8 nm的N-CQDs，该N-CQDs显示了良好的生物相容性和低细胞毒性，可用于体外HepG2细胞成像。此外，邻硝基苯酚可与N-CQDs的表面亲水性基团(—COOH、—OH和—NH2)进行选择性络合导致量子点的荧光猝灭，荧光猝灭程度与邻硝基苯酚浓度在0.083 3～12.0 μmol/L范围内具有良好线性关系，检出限为25.2 nmol/L。所建立的方法简单、快速，应用于环境水样中邻硝基苯酚的测定，结果满意。