丙泊酚通过上调miR-204对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭迁移和上皮间充质转化的影响①

崔 鹏 胡 杰 王晓飞 夏玉中 阮孝国 蔡 明 (郑州大学附属洛阳中心医院麻醉科,郑州 471000)

乳腺癌是临床上最为常见的妇科肿瘤，是导致世界范围内的女性死亡的首要原因之一。由于发展中国家对早期诊断的忽视，乳腺癌患者的生存率远低于发达国家，5年生存率不到40%[1]。外科手术切除治疗是现今治疗乳腺癌的一线方案，局部或转移性复发是导致术后患者死亡的主要原因之一，在手术期间往往会导致应激反应，造成细胞免疫抑制，加速肿瘤生长及扩散，而麻醉药的选择对缓解肿瘤的手术治疗中的应激反应至关重要[2,3]。丙泊酚是一种临床上广泛使用的短效静脉麻醉药，大量研究表明其在肿瘤治疗过程中发挥肿瘤抑制作用，然而其作用机制还有待进一步明确[4]。本研究培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231，并通过丙泊酚和miR-204 inhibitor处理，探究了丙泊酚对miR-204的影响及其对乳腺癌细胞侵袭迁移和上皮间充质转化的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 DMEM细胞培养液、胎牛血清购自Gibco公司；Lipofectamine 2000购自Thermo Fisher公司；丙泊酚购自Sigma公司，miR-204 mimic、miR-204 inhibitor、阴性对照mimic(mimic NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；所有引物由上海生工生物工程有限公司合成；反转录试剂盒和SsoFastTMEva-Green®Supermix试剂盒购自Bio-Rad公司；TRIzol试剂、RIPA试剂购自上海碧云天生物技术研究所；荧光素酶报告系统购自Promega公司；GAPDH抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)一抗，HRP酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Abcam公司。

1.1.2细胞来源 人乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中科院上海细胞库，采用含100 U/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素，10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养，细胞株在37℃，5%CO2的环境条件下生长。

1.2方法

1.2.1分组及处理方法 MDA-MB-231细胞分为对照(Control)组，Propofol组，miR-204 inhibitor组和Propofol+miR-204 inhibitor组，其中Control组正常培养48 h；Propofol组在转染mimic NC 24 h后换液采用5 μg/ml的丙泊酚处理24 h；miR-204 inhibitor组在转染miR-204 inhibitor 24 h后，换液继续培养24 h；Propofol+miR-204 inhibitor组按照Lipofectamine 2000说明书转染miR-204 inhibitor 24 h后，换液再经过5 μg/ml的丙泊酚进行处理24 h。收集各组细胞用于后续实验。

1.2.2RT-PCR检测mRNA及miRNA水平 TRIzol法提取RNA，反转录获取cDNA，根据SsoFastTMEva-Green®Supermix试剂盒说明配制反应体系检测各组RNA水平，PCR扩增条件为：95℃预变性2 min，95℃变性5 s，60℃退火10 s，反应进行40个循环，2-ΔΔCt法处理实验结果。

1.2.3Transwell法检测细胞侵袭 向Transwell小室中加入50 μl基质胶，并于37℃条件下凝固，向小室上室中加入无血清细胞培养液，下室中加入完全培养液，将细胞接种于上室，常规环境条件下培养48 h。洗掉未通过基质胶的细胞，多聚甲醛固定剩余细胞，1%结晶紫染色15～20 min，显微镜下观察细胞透过情况，平均每个小室取6个视野进行计数，取平均值评价细胞侵袭能力。

1.2.4划痕愈合法检测细胞迁移 将细胞接种于6孔板，常规条件下培养至细胞铺满板内80%的空间后，使用中枪头对细胞划线，PBS缓冲液清洗剥落的细胞残渣，常规条件下继续培养24 h，显微镜拍照，使用Image proPlus软件分析0 h和24 h细胞划痕边界距离，0 h距离减去24 h距离既得24 h细胞迁移距离。

1.2.5Western blot检测蛋白表达 RIPA试剂提取样品总蛋白，定量后以30 μg/孔上样，10%SDS-PAGE电泳分离各组蛋白，转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，兔一抗4℃孵育过夜后TBST缓冲液漂洗，加入HRP酶标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h后ECL显色。

1.2.6荧光素酶报告基因实验检测miRNA靶向作用 利用生物信息学网站Targetscan预测miR-204和MMP-9的靶向作用位点，构建psi-MMP-9 3′UTR载体，并根据Lipofectamine 2000说明书与miR-204 mimic同时转染293T细胞，48 h后检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1丙泊酚提高MDA-MB-231细胞中miR-204的表达 如图1A所示，与Control组相比，Propofol(2、5、10)μg/ml组MDA-MB-231细胞中miR-204表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；后续实验以5 μg/ml浓度进行，如图1B所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞中miR-204表达显著升高，miR-204 inhibitor组miR-204表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204 inhibitor组miR-204表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 RT-PCR检测乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-204表达

2.2丙泊酚抑制MDA-MB-231细胞侵袭 如图2所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞的侵袭细胞数目显著减少，miR-204 inhibitor组的侵袭细胞数目显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204 inhibitor组侵袭细胞数目显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 Transwell检测乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭能力

2.3丙泊酚抑制MDA-MB-231细胞迁移 如图3所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞的划痕愈合率显著降低，miR-204 inhibitor组划痕愈合率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204inhibitor组划痕愈合率显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 划痕愈合法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力

2.4丙泊酚抑制MDA-MB-231细胞的上皮间充质转化 如图4所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞中E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著降低，miR-204 inhibitor组E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204 inhibitor组E-cadherin蛋白表达显著降低，N-cadherin和Vimentin蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图4 Western blot检测上皮间充质转化标志蛋白表达

2.5丙泊酚抑制MMP-9在MDA-MB-231细胞中的基因转录 如图5所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞中MMP-9基因转录显著降低，miR-204 inhibitor组MMP-9基因转录显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204 inhibitor组中MMP-9基因转录显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图5 RT-PCR法检测MMP-9的基因转录

2.6丙泊酚抑制MMP-9在MDA-MB-231细胞中的蛋白表达 如图6所示，与Control组相比，Propofol组MDA-MB-231细胞中MMP-9蛋白表达显著降低，miR-204 inhibitor组MMP-9蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与Propofol组相比，Propofol+miR-204 inhibitor组中MMP-9蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

图6 蛋白印迹法检测MMP-9的蛋白表达

2.7miR-204靶向作用于MMP-9 如图7所示，与WT MMP-9+mimic NC比较，WT MMP-9+miR-204 mimic中荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，MUT MMP-9+mimic NC和MUT MMP-9+miR-204 mimic比较差异无统计学意义。

图7 荧光素酶报告实验检测miR-204和MMP-9靶向作用关系

3 讨论

丙泊酚是一种常见的静脉麻醉药，大量证据表明丙泊酚可通过直接或间接的方式影响肿瘤的生长和转移。调控miRNA表达是丙泊酚发挥抑癌作用的重要机制之一。研究表明丙泊酚可通过调控miR-24、miR-9、miR-34a-5p等miRNA对肿瘤的生长和转移发挥调控作用，而丙泊酚对miR-204是否具有调控作用还未见报道，尽管两者都可以通过调控MMP-9发挥抑癌作用[5-9]。本研究检测了不同浓度丙泊酚处理条件下乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-204的表达，发现丙泊酚可浓度依赖性地上调miR-204表达，表明丙泊酚对乳腺癌细胞miR-204的表达具有促进作用。

肿瘤细胞具有易转移的特征，上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤细胞转移最重要的机制。EMT可使肿瘤细胞外围基质降解，使细胞和基质间的黏附作用丢失，从而进入循环系统入侵到其他组织和器官形成转移灶[10,11]。研究表明，丙泊酚对乳腺癌细胞的侵袭和迁移具有显著的抑制作用[8,12]。本研究发现丙泊酚可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭和迁移，并上调E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达。E-cadherin在上皮细胞形态、细胞间接触、细胞极性、细胞外基质和骨架的维持等方面具有重要作用，N-cadherin则在成纤维细胞形态、提高细胞运动和侵袭作用上起重要作用，E-cadherin的丢失和N-cadherin的上调是EMT过程中的关键事件，Vimentin是一种细胞骨架的关键蛋白，具有调控微管、肌动蛋白、黏着斑和迁移细胞间的黏着连接的作用，在EMT过程中起重要作用，三者都常用作检测细胞EMT的标志物[13-17]。此外，通过miR-204 inhibitor处理细胞，发现miR-204表达下调，可显著逆转丙泊酚对细胞侵袭、迁移及EMT的抑制作用。结合上述结果表明，丙泊酚可通过上调miR-204抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移及EMT。

细胞外基质的降解在乳腺癌增殖、侵袭迁移等过程中起重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族是一类分解细胞外基质的Zn-蛋白水解酶类，其中MMP-9是降解细胞外基质的主要酶之一[18,19]，乳腺癌术后局部复发患者肿瘤组织中MMP-9的阳性表达与患者的不良预后密切相关[20]。Li等[8]研究发现，丙泊酚可浓度依赖性地下调MMP-9的表达；而Luan等[9]研究则表明恶性黑色素瘤中的miR-204可通过靶向下调MMP-9表达发挥肿瘤抑制作用。本研究发现丙泊酚可显著降低MMP-9的基因转录和蛋白表达，与既往研究结果一致。本研究通过miR-204 inhibitor下调miR-204表达后发现，miR-204下调可恢复MMP-9的基因转录和蛋白表达，荧光素酶报告基因实验也表明miR-204可靶向作用于MMP-9，提示丙泊酚可通过上调miR-204靶向抑制MMP-9表达。

综上所述，丙泊酚可上调miR-204表达，而miR-204可通过靶向作用于MMP-9抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移及EMT。本研究为丙泊酚治疗癌症的作用机制提供了新的理解，为丙泊酚的临床应用提供了新的参考。