益母草碱对胚胎-胎仔发育毒性和遗传毒性的评价

田逸君，朱玉平，马玺里，严 朗，勝呂綸貴子，郑怡文 （. 海军军医大学海军医学系卫生毒理学教研室，上海 00433；. 复旦大学药学院，上海 00433）

益母草（Leonurus japonicusHoutt.）作为传统中药，以往主要用于治疗妇产科疾病。近年来的研究发现，益母草中的主要化学成分为生物碱、类黄酮和二萜等[1]，其中，益母草碱（4-胍基-正丁基-丁香酸酯，又名SCM-198）是一种具有抗血小板聚集[2]、改善微循环、保护心肌[3-4]等多种生物活性的重要生物碱，有广泛的临床应用前景[5-7]。本研究采用SD 大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验方法对益母草碱的致畸性进行评价；同时采用Ames 试验、体外CHO 细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验这3 个标准试验组合的方法，分别从体外到体内，从微生物、离体真核细胞到整体动物水平系统检测其致突变性[8-9]，旨在为临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 受试物

益母草碱（含量99.09%，复旦大学药学院，批号：20 110 329）。使用前以0.5% CMC-Na 溶液配制成混悬液，供试；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：F20100420，国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（批号：T20101110，国药集团化学试剂有限公司）；丝裂霉素C（批号：101 202，浙江海正药业股份有限公司）；环磷酰胺（ 批号：10 110 621，江苏恒瑞药业股份有限公司）；敌克松（批号：PS-262）、甲基磺酸甲酯（批号：129 925）、4-硝基喹啉-N-氧化物（批号：N8141）、2-氨基芴（批号：A5550-0）、1,8-二羟基蒽醌（批号：S52075-139）均购自Sigma 公司；大鼠肝微粒体酶S9（批号：2 715，美国Moltox 公司）；组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌共5 支，分别为TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株，由国家上海新药安全性评价中心赠予，储存于液氮中。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予,储存于液氮中。

1.2 试验动物

SD 大鼠（SPF 级），雌性100 只，雄性80 只。雌鼠5～6 周龄，体重110～140 g；雄鼠6～7 周龄，体重150～180 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001629237。ICR 小鼠（SPF 级），共46 只，雌 雄各半。雌鼠7～8 周龄，体重21～23 g；雄鼠7～8 周龄，体重23～25 g（上海西普尔－必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001610906。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2007-0003。

2 方法

2.1 胚胎-胎鼠发育毒性试验

按《药物生殖毒性研究技术指导原则》[10-11]的要求，将雌鼠与雄鼠1:1 合笼，交配第2 天起对雌鼠进行阴道涂片检查，若显微镜下查见精子则视为交配成功，成功当天即为妊娠GD0。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4 组，每组20 只。急性毒性试验结果提示SD 大鼠经口灌胃给予益母草碱，最大耐受量（MTD）＞5 000 mg/kg，因此，本试验设高、中、低剂量组（2 000、1 000 和500 mg/kg 体重），另设溶媒对照组，分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d（给药起止时间为GD6～GD15）。于GD0、GD5、GD6～GD15和GD20时称取孕鼠的体重。在GD20时处死孕鼠，观察外观是否异常，同时记录其活胎数（区分雌雄）、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠，取其中约一半数量固定于Bouin 液中作内脏检查，另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本，用于骨骼畸形检查。

2.2 遗传毒性试验

按《药物遗传毒性研究技术指导原则》[12-13]的要求，分别应用反映基因突变的Ames 试验[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验（体外培养CHO细胞）[15]和小鼠微核试验（体内）[16]方法。

2.2.1 Ames 试验

应用TA97、TA98、TA100、TA102 和TA1535 这5 支菌株，设5 个剂量组（5 000、500、50、5、0.5 μg/皿），此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组，每个剂量组及对照组均设3 个平行皿（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在有或无代谢活化系统S9 的条件下接触受试物，并用最低极限的琼脂培养基培养48～72 h 后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较[8,17-18]。重复试验一次。

2.2.2 染色体畸变试验

在有或无代谢活化系统S9 的条件下，在体外培养的CHO 细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品，反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1 000、500 和250 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C 和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml，另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液，继续培养至24 h，最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞，将细胞终止在有丝分裂中期，经0.75%氯化钾低渗、1∶3 醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa 染色后，在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变[8,17-18]。

表1 阳性对照品的名称及剂量

观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞，采用盲法读片，受试物及溶媒对照组每组观察200 个细胞，阳性对照组观察100 个细胞，计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目[8,17-18]（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），计算畸变率。

2.2.3 骨髓微核试验

受试物采用经口灌胃的方式（与临床给药途径一致）给药，急性毒性试验结果提示ICR 小鼠经口灌胃给予益母草碱，MTD＞5 000 mg/kg，故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000 和500 mg/kg 体重，同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg 体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺（阳性对照），给药容量为10 ml/kg 体重。溶媒对照组以10 ml/kg 体重的容积经口灌胃给予0.5%CMC-Na 溶液。小鼠在给药24 h 后处死，每只动物取其两侧股骨骨髓，制2 张涂片，用甲醇固定，然后用pH6.8 的Giemsa 染液进行染色。

每只小鼠镜检1 000 个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE 数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200 个PCE 计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE 值，以评价受试物是否有骨髓毒性[8,17-18]。

3 统计分析[8, 17-18]

3.1 胚胎-胎鼠发育毒性试验

3.2 Ames 试验

比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2 倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在剂量-反应关系，则判断为阳性。

3.3 染色体畸变试验

染色体畸变细胞的发生率须与溶媒对照组进行比较分析后方可判定，＞10%者判为阳性。

3.4 骨髓微核试验

采用χ2检验比较给药组与对照组之间的差异是否具有统计学意义。

4 结果

4.1 胚胎-胎鼠发育毒性结果

益母草碱各受试剂量作用下在给药期间（GD6～GD15）、停药后（GD15～GD20）以及整个孕期（GD0～GD20）孕鼠的增重与对照组相比，差异均无统计学意义；各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比，差异均无统计学意义；此外，各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示，益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。

由表2 可见，受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。

由表3～5 可见，受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。

表2 益母草碱对胎鼠生长发育的影响

4.2 Ames 试验结果

受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染，并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6、表7，5 个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象[8,17-19]。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9 的条件下，对5 支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量-反应关系（表8）。

表3 益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响

4.3 染色体畸变试验结果

阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h 在有或无代谢活化系统S9 的情况下，染色体畸变率分别为17%和18%，均＞10%，为阳性结果；溶媒对照品以及250、500 和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9 组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%；24 h、无S9 组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%，综上，溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，为阴性结果[8,17-18]。

4.4 小鼠骨髓微核试验的结果

各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE 微核发生率分别为4.09‰和2.94‰，阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE 微核发生率分别为15.93‰和16.28‰，与溶媒对照组相比，差异均有统计学意义，受试物在500、1 000、2 000 mg/kg 剂量下对雌性ICR 小鼠骨髓PCE 微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰，对雄性ICR小鼠骨髓PCE 微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰，由上述结果可见，受试物各剂量组均未诱发ICR 小鼠骨髓PCE 微核率的明显增高[8,17-18,20]。

表4 益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响

表5 益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响

表6 益母草碱对5 支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿, ± s)（第1 次）

表6 益母草碱对5 支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿, ± s)（第1 次）

组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2空白对照组 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3溶媒对照组 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1阳性对照组 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15

表7 益母草碱对5 支菌株的回变菌落数(个/皿， ±s )（第2 次）

表7 益母草碱对5 支菌株的回变菌落数(个/皿， ±s )（第2 次）

组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5空白对照组 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1溶媒对照组 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2阳性对照组 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53

表8 益母草碱对24 h 体外培养CHO 细胞的染色体畸变试验结果（加或不加S9 系统）

表9 益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果

5 讨论

益母草作为传统中药，其应用广泛且历史悠久，主要用于治疗月经不调、痛经、恶露等妇科疾病，同时还用于消肿化瘀、排水利尿。而现代医学已证明益母草中的生物碱——益母草碱在其中发挥了主要功效，益母草碱具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制红细胞和血小板聚集[2]等多种功能，对改善微循环、抗自由基活性和减少细胞内钙超载[3-4]也有显著作用。上述功能有助于预防心血管疾病和脑血管疾病，抑制心肌纤维化[7]、改善认知、促进神经元修复[21]、抗炎[22]、防治糖尿病[23]等，因此，益母草碱在心脑血管、代谢病、肾病、生殖[24]等临床研究领域有相当广泛的应用前景[5-7]。进行安全性评价是药物研发和安全使用的重要环节，但目前对益母草碱的基础毒性和特殊毒性的研究尚未见相关文献报道。研究其遗传毒性和生殖毒性对于临床安全用药具有重要的指导意义。

本研究采用国际通用的研究方法，对益母草碱的生殖毒性和遗传毒性进行了系统的评价。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，自大鼠胚胎着床至硬腭闭合这个阶段孕鼠口服益母草碱，通过观察受试物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响检测其致畸性。药物遗传毒性的研究根据国家相关标准，必须遵循原核生物与真核生物、体内系统与体外系统相结合的原则进行，本研究采用Ames 试验、体外CHO 细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三者标准组合方案，其检测范围涵盖了基因突变、染色体结构和数目畸变等多个遗传学终点。Ames 试验用于检测DNA 损伤引起的基因突变，组氨酸营养缺陷型（his-）鼠伤寒沙门菌在受到诱变剂作用后会发生大量回复突变，可自行合成组氨酸，形成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化后才具有致突变作用，因此，在测试系统中又设置了平行组加入哺乳动物微粒体酶，以弥补体外试验缺乏代谢活化系统的不足。染色体畸变试验常用于检测化合物是否引起细胞染色体结构和数目的改变。诱变因素在损伤染色体的同时也可能损伤纺锤体，从而导致染色体的丢失并形成微核，应用微核试验检测染色体或有丝分裂器的损伤，具有直观、简便等优势[9]。

研究结果显示，在本试验剂量条件下，益母草碱未观察到明显的胚胎-胎仔发育毒性以及遗传毒性，该结论可为益母草碱在临床上的安全使用提供参考和指导，有助于降低用药风险。