芪贞降糖颗粒对糖尿病肾病大鼠肾功能的改善作用研究

周娅红， 方朝晖， 姜 辉， 何云娇， 刘晓闯， 沈 悦

(1安徽中医药大学第一附属医院药学部， 合肥 230031； 2安徽中医药大学中西医结合临床学院， 合肥 230012)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由高血糖诱发的糖尿病微血管并发症，临床表现为高血压、蛋白尿、水肿等特征[1-2]，其发病机制复杂多样，涉及炎症感染、自身免疫、遗传、环境因素、饮食习惯等诸多因素[3-4]。DN的发病率约占糖尿病患者总人数的20%～40%，患者发展到终末期会引起肾小球硬化症，引发肾功能衰竭[5-6]。目前临床上多以控制患者血糖、血压、饮食干预及肾脏替代疗法等治疗手段[7-8]。芪贞降糖颗粒为安徽中医药大学第一附属医院治疗糖尿病的特色医院制剂，由黄芪、女贞子、山茱萸、黄连、五倍子等组成，临床应用多年，疗效明确[9-10]，具有降糖调脂，治疗2型糖尿病(T2DM)的作用。本研究采用DN大鼠为模型探究芪贞降糖颗粒对DN的治疗作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器AUUC-CHEK型血糖仪(上海罗氏有限公司)；D3024R型高速冷冻型微量离心机(美国DragonLab公司)；ZT-12M型全密封自动脱水机(湖北亚光医用电子技术有限公司)，YB-7LF型组织包埋机(湖北亚光医用电子技术有限公司)；H-7650型 日立透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.2 试药芪贞降糖颗粒(安徽中医药大学第一附属医院药房自制，批号：20180621)；二甲双胍片(上海信谊天平药业有限公司，批号：67190605)；链脲佐菌素(美国 Sigma公司，批号：SLBB8126V)；PBS缓冲液(美国Zsbio公司，批号：18070201)；SCr检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190318)；BUN检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190324)。

1.3 动物清洁级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，共60只，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(皖)2011-002。

2 方法

2.1 动物模型的建立将60只SD大鼠正常饲养1周后，随机取10只给予基础饲料饲养，剩余50只大鼠给予高酯饲料喂养，饲养4周后，禁食12 h，高酯饲养大鼠按35 mg/kg体质量腹腔注射0.1 mol/L STZ溶液，基础饲养大鼠注射等量的柠檬酸缓冲溶液。1周后测大鼠尾静脉空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L为DN的成模标准[11-12]。

2.2 分组及给药方法将成模的50只大鼠随机分为模型组、二甲双胍组(二甲双胍180 mg/kg体质量)、芪贞降糖颗粒低、中、高剂量组(芪贞降糖颗粒50、100、200 mg/kg体质量),每组10只。10只未建模大鼠为正常组,模型组和正常组大鼠灌服等体积纯化水，各组大鼠连续给药8周。

2.3 指标的测定

2.3.1 体质量的测定 称量各组大鼠给药后0、4、8周的体质量值。

2.3.2 空腹血糖(FBG)的测定 采用尾静脉消毒后针刺取血，测定各组大鼠建模成功后0、4、8周的FBG值。

2.3.3 血脂TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的测定 实验结束前大鼠禁食12 h，腹腔注射3.5%水合氯醛溶液麻醉处理，腹主动脉取血，分离血清，紫外分光光度法测定血脂含量。

2.3.4 血清SCr和BUN含量的测定 吸取各组大鼠血清适量，按试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附法检测血清SCr和BUN含量。

2.3.5 肾组织IL-1、IL-6和TNF-α含量的测定 取各组大鼠肾组织，用预冷的PBS溶液冲洗后破碎处理，均浆后分离得到上清，采用酶联免疫吸附法测定IL-1、IL-6和TNF-α含量。

2.3.6 肾组织病理学的改变 取各组大鼠肾皮质适量，固定，常规脱水，包埋，制备石蜡切片，HE染色观察肾组织病理改变。

2.3.7 肾足细胞超微结构的改变 将肾皮质固定在4%的戊二醛溶液中，PBS缓冲液冲洗后，用丙酮处理液脱水，环氧树脂包埋，切成50 nm厚度的薄片，用透射电镜观察肾小球基底膜厚度和足细胞的变化情况。

3 结果

3.1 各组大鼠给药前后体质量的比较各组大鼠给药前体质量差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，二甲双胍组、芪贞降糖颗粒各剂量组大鼠给药后体质量均升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与二甲双胍组给药后相比，芪贞降糖颗粒各剂量组大鼠给药后体质量均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3.2 各组大鼠给药前后FBG含量的比较各组大鼠给药前FBG差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，二甲双胍组、芪贞降糖颗粒组高、中剂量组给药后大鼠FBG均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与二甲双胍组给药后相比，芪贞降糖颗低剂量组给药后大鼠FBG均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表1 各组大鼠给药前后体质量的比较

表2 各组大鼠给药前后FBG含量的比较

3.3 各组大鼠给药后血脂含量的比较与模型组相比，二甲双胍组、芪贞降糖颗粒组高、中、低剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均降低，HDL-C含量升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表3。

3.4 各组大鼠给药后血清SCr和BUN含量的比较与模型组相比，二甲双胍组、芪贞降糖颗粒组高、中、低剂量组大鼠血清SCr和BUN含量均降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与二甲双胍组相比，芪贞降糖颗粒低、中剂量组大鼠血清SCr和BUN含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表4。

3.5 各组大鼠给药后肾组织IL-1、IL-6和TNF-α含量的比较与模型组相比，二甲双胍组和芪贞降糖颗粒高、中、低剂量组大鼠肾组织IL-1、IL-6和TNF-α含量均降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与二甲双胍组相比，芪贞降糖颗粒低、中剂量组大鼠肾组织IL-1、IL-6和TNF-α含量均升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表5。

3.6 各组大鼠肾组织病理学的改变情况正常组肾小球结构完整，肾小管结构清晰，基底膜基质未现异常变化；模型组肾小球细胞排列紊乱，体积变小，肾小管细胞存在空泡化和基底膜增厚现象。芪贞降糖颗粒高、中、低剂量组肾小球细胞结构基本完整，排列较规则，肾小球基底膜增生现象较模型组有所改善，见图1。

3.7 各组大鼠肾小球足细胞超微结构的改变情况正常组肾小球足细胞结构完整，排列整齐，足突间无沉淀物聚集。模型组肾小球足细胞基底膜存在增生，伴随有致密物聚集，足细胞排列紊乱，出现空泡化。芪贞降糖颗粒高、中、低剂量组肾小球足细胞基底膜增厚现象较模型组有所减轻，足细胞排列较整齐，细胞内有少许基质损伤，存在轻微融合现象，见图2。

表3 各组大鼠给药后血脂含量的比较

表4 各组大鼠给药后血清SCr和BUN含量的比较

表5 各组大鼠IL-1、IL-6和TNF-α的表达

A： 正常组

B：模型组

C： 二甲双胍组

D：芪贞降糖颗粒低剂量组

E：芪贞降糖颗粒中剂量组

F：芪贞降糖颗粒高剂量组

A： 正常组

B：模型组

C： 二甲双胍组

D：芪贞降糖颗粒低剂量组

E：芪贞降糖颗粒中剂量组

F：芪贞降糖颗粒高剂量组

4 讨论

STZ腹腔注射结合高脂饮食诱导是现阶段制备DN模型的常用方法，该法简单易行，模型特征稳定，与人类早期DN的发病指征相似，是研究DN及微血管并发症的的理想模型[13-14]。本研究发现，模型组大鼠体质量降低，FBG、血脂水平高于正常组大鼠，表明DN模型具有高血糖、高血脂的特征，同时伴随体重降低现象，此结果与文献[15-16]报道一致。当肾组织出现损伤时，肾小球通透性随之增加，滤过率继而降低，由此引发血清中SCr和BUN的浓度升高。由本研究结果可知，与模型组相比，芪贞降糖颗粒组大鼠SCr和BUN存在不同程度的降低，证实芪贞降糖颗粒具有提高肾小球滤过率，减轻肾损伤的作用，同时能够降低肾脏炎性因子释放，降低细胞膜及细胞结构损伤。结合肾组织病理形态学和电镜观察发现，模型组因持续高血糖和炎性浸润，大鼠肾组织损伤较明显，肾小球出现明显萎缩现象，进一步加重了肾小球硬化症及肾衰的发生率。经芪贞降糖颗粒治疗后，在一定程度上延缓了大鼠肾小球细胞的形态改变，减轻了基底膜的增厚及间质纤维化现象的发生，同时也促进肾小管上皮细胞的形态稳定，提高肾小球细胞的滤过功能，减轻肾组织纤维化的影响，起到对肾功能的保护作用。综上所述，芪贞降糖颗粒能够降低DN大鼠FBG、血脂含量、血清SCr和BUN含量以及炎性因子表达，其作用机制与增加肾组织细胞稳定，改善肾小球基底膜厚度和纤维化程度有关。