贵州雷公山2种块菌属外生菌根的形态学与分子生物学研究

张文泉，罗国涛，闫 伟

（1.凯里学院，贵州 凯里 556011；2.内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010019）

块菌又称为松露、猪拱菌，是块菌科Tuberaceae块菌属Tuber外生菌根的子实体，在欧美地区称之为厨房中的黑宝石，营养丰富，价值极高[1]。研究表明：全球范围内，块菌属真菌，约60种以上，世界范围均有分布[2-5]，多集中在温带森林地区，在干旱的荒漠、半荒漠地带及亚热带的林区偶有发现。我国主要分布于东北到西南地区这一条带上，云南、四川等省尤其丰富，西北的新疆、西藏、内蒙古、甘肃等地均见报道，多出现于海拔1 500 m以上的针叶林或针阔混交林下。对中国块菌的分布、种类及数量进行研究及统计[6-12]得出：中国近13个省市自治区发现有块菌分布，种类达30种。以往对块菌种类的鉴定多采用形态学上的分类方法，但由于环境因子及地域差异，造成同一菌根真菌所形成的外生菌根形态上的变化千差万别，导致分类上出现分歧，随着现代生物技术的发展，分子生物学技术在菌根分类学上的应用，块菌的分类鉴定进入新的阶段，目前，多采用ITS区段的基因核酸序列分析对块菌种类进行鉴定。

本研究在对雷公山国家级自然保护区外生菌根真菌进行资源调查中发现存在块菌属的外生菌根真菌，故对其进行进一步调查研究。

1 研究地概况

雷公山国家级自然保护区位于26°15′～26°32′N，108°5′～108°24′E，属贵州东南部的雷山县，总面积47 792 hm2，最高峰海拔为2 178.8 m，气候类型多样，生物资源丰富，海拔1 300 m为常绿阔叶林，气候温暖湿润，多为黄壤，土壤肥力高，树种组成复杂，具有丰富的植物种类；海拔1 300～2 100 m为常绿落叶混交林，气候湿润清凉，多为黄棕壤，植被中常绿成分减少；海拔2 100 m以上为高山灌丛，年平均气温低，风大，土层较薄，为草甸土，植物种类较少，常见大白杜鹃、箭竹等。

2 材料和方法

2.1 材 料

实验样品于2018—2019年6—8月在雷公山自然保护区的四类优势林分（常绿阔叶林、落叶阔叶林、针叶林、灌丛）中分别设置5个样地，每一样地中采用随机取样法，在样树周围挖取深度20 cm左右带小根的土样。

2.2 方 法

2.2.1 形态分类学的鉴定

将土样置于双蒸水中浸泡，挑出断根后洗净，剪短，体式显微镜下挑出菌根，并依据菌根的颜色、分支类型、表面性状、外延菌丝等形态特征进行分类，每一类型保存两份。一份采用FAA固定液保存，对其外部形态特征进行描述，并剥离菌套，制成临时玻片，对显微结构进行观察描述。菌根的外部形态采用Olympus体视显微镜在10×4倍条件下观察。菌根菌丝及剥离菌套的内、外表面解剖结构均采用Olympus生物显微镜分别在10×40倍条件与10×100倍条件下观察。另一份采用CTAB缓冲液保存。

2.2.2 分子生物学的鉴定及分析

1）PCR扩增

将保存于CTAB缓冲液中的菌根挑取2～3个根尖，采用CTAB法提取总DNA，以ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA） 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）为引物进行PCR，PCR后得到的扩增产物凝胶电泳检测后，采用DNA试剂盒回收扩增的条带，进行纯化后送生物工程公司直接测序。

2）系统发育分析

采用Blast软件，对所测ITS区段DNA序列在NCBI数据库Genbank中搜索同源序列，进行比较分析并采用Mega7.0软件，构建系统发育树，确定其分类地位。

3 结果与分析

3.1 形态学及解剖学特征

T1菌根系统多不分支，或为单轴，极少数二叉分支，分支为1～2级，菌根主轴长度为1.1±0.4 cm，菌根直径为0.2±0.05 cm，其颜色为淡黄色至黄色之间，菌根末端未分支的部位多呈棒状、念珠状，菌根由基部至顶部依次变小，呈三角形，菌根表皮光滑，菌根仅有极少量稀疏缠绕在未分支末端的外延菌丝，且较短，无根状菌索，无囊状体，无菌核（图1A—B）。外层菌套的菌套类型为M型，内表面菌丝平行排列，细胞壁薄，内层菌套为H型，基部细胞的细胞壁稍厚，其他细胞的细胞壁薄，菌丝有隔无锁状联合，由菌丝套延伸出（图1E—F）。

T2菌根系统为二叉分支，分支1～2级，菌根的末端尖状，主轴长2.1±0.3 cm，直径为0.1±0.03 cm，菌根颜色为棕褐色至褐色，菌根幼嫩部分颜色浅，发亮，菌根末端存在极少量稀疏的外延菌丝，外延菌丝呈绒毛状，无根状菌索，无囊状体，无菌核（图2A—B）。外层菌套的菌套类型为Q型，菌丝细胞排列整齐，细胞壁较薄，内层菌套为E型，菌丝膨大，较多分支，且紧密缠绕弯曲，菌丝有隔无锁状联合（图1E—F）。

图1 T1菌根的外部形态与解剖结构Fig.1 External morphology and anatomical structure of T1

图2 T2菌根的外部形态与解剖结构Fig.2 External morphology and anatomical structure of T2

3.2 PCR扩增

对供试菌根中均提取的基因组DNA，经琼脂糖凝胶检测为单一的清晰条带，所得样品浓度大于100 μg/mL，采用紫外分光光度检测法得出OD260/OD280＞1.7，由此可知：该实验中所提取到的基因组DNA可满足后续实验的要求。进一步进行PCR扩增，PCR中采用的模板为上步实验提取的基因组DNA，引物为真菌特异性序列ITS区段的ITS1F、ITS4，进行PCR扩增实验得样品的ITS区段部分序列，所得序列经凝胶电泳检测得知PCR产物片段大小均在700 bp左右，与实验预期所需得到的片段大小基本一致，即可回收测序。

3.3 系统发育树结果分析

运用Genbank中的BLAST，引用NCBI数据库中隶属于块菌属Tuber的ITS区段序列，即印度块菌T.indicum序列4个，喜马拉雅块菌T.himalayense序列1个，黑孢块菌T.melanosporum序列3个，刘氏块菌T.liui序列1个，中甸块菌T.zhongdianense序列2个，夏块菌T.aestivum序列3个，冬块菌T.brumale序列2个。对PCR经测序后所获得序列进行规范性修改，外类群的确定用Mega7.0进行序列对比与排序，得系统发育树的拓扑结构，结果如图3所示。

由此进化树分析可知：目标序列T1、T2均与印度块菌聚在一枝，但T1与印度块菌、黑孢块菌、夏块菌、冬块菌4种类型的块菌序列聚成一枝，且支持率高，为96%。中甸块菌与刘氏块菌另聚成一枝，二者支持率为80%，其中印度块菌与喜马拉雅块菌聚为一枝，支持率为90%，喜马拉雅块菌、印度块菌作为一组与黑孢块菌聚为一个亚枝，支持率为94%，由此可知刘氏块菌与中甸块菌的亲缘关系较近；喜马拉雅块菌与印度块菌的亲缘关系较近，喜马拉雅块菌与印度块菌、黑孢块菌在遗传关系上比较相近。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

目标序列T1以96%的支持率与印度块菌在系统发育树中聚为一亚支，证明目标序列T1为印度块菌所形成的外生菌根真菌，目标序列T2与印度块菌在系统发育树中虽然聚为一支，但支持率较低，仅为60%，初步确定目标序列T2为块菌属的一个种，与印度块菌有较近的亲缘关系。

4 结论与讨论

本研究对贵州雷公山所采集的T1、T2外生菌根进行形态学与分子生物学研究后得出结论：这2种外生菌根均为块菌属外生菌根，T1为印度块菌属外生菌根，T2为块菌属的一种。

本研究对所采集的菌根样品经形态学分类后再进行分子生物学鉴定，样品T1、T2与块菌属序列比对并构建系统进化发育树，得出二者为块菌属外生菌根真菌，由系统发育树上分析：样品T1、T2二者与印度块菌具有较近的亲缘关系，样品T1与印度块菌在系统发育树上支持率极高，达96%，形态学特征上，T1菌根颜色较浅，分支较少，外延菌丝少而且稀疏，菌丝细胞的细胞壁薄等特征均与之前报道的白桦、樟子松[12-13]上所采集的印度块菌菌根的形态结构相似，由此可确定T1为印度块菌菌根。T2与印度块菌在系统发育树中虽然聚为一支，但支持率较低，仅为60%。

T2菌根多二叉分支，颜色略深，菌丝紧密缠绕，弯曲，这些形态学上的特征与所报道的印度块菌菌根的形态结构略有不同，由此只能确定为块菌属的一种菌根，与印度块菌有较近的亲缘关系，具体为哪一个种还需要进一步研究论证。

块菌属真菌资源的调查多依赖于对子实体的采集鉴定，但子实体的产生与外界环境因素有较大的关系，在未发现子实体的区域是否有块菌属菌根真菌资源存在。依据新近报道，我国拥有丰富的块菌属菌根资源，且有其不同于国外块菌属菌根的独特特征，目前尚存在大量未被发现的块菌属外生菌根的新分类群[14-17]，是否可以通过采集菌根后，对其形态学与分子生物学相结合的方法进行调查研究，对未形成子实体的块菌属真菌资源进行调查，此类研究还有待进一步开展。

由本研究得知，雷公山国家自然保护区存在块菌属外生菌根真菌，但多年的调查研究均未采集到子实体，该地区哪些地理环境因素限制了块菌子实体的产生还有待进一步的研究