胰液中循环游离DNA甲基化异常在胰腺癌早期诊断中的应用

周 艳，宁 波

重庆医科大学附属第二医院 消化内科，重庆 400000

胰腺癌是世界上最致命的癌症之一，是中国第六大癌症相关死亡原因[1]和全球第七大癌症相关死亡原因[2]，其5年生存率不超过5%[3]。由于胰腺其位于腹膜后深层的特殊解剖位置，且毗邻十二指肠和胆总管，以及其临床症状的非特异性，使得患者确诊时往往已经错过了最佳治疗时期。只有少数患者在诊断时可以进行根治性切除[4]，且术后根治性切除率不足20%[5]。早期诊断胰腺癌是改善其预后的最佳和目前唯一的选择[4]。目前临床应用最广泛的血清肿瘤标志物(CA19-9、CEA)特异度较低，在急性胰腺炎、急性肝炎、肝硬化、胃癌等疾病中也可能出现升高。诊断胰腺癌的影像学手段主要有CT、MRCP及MRI，内镜手段如经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)和内镜超声(EUS)。但胰腺存在诸多占位性质的病变，除了胰腺癌以外，还有胰腺炎性实性占位、异位组织及囊性及囊实性占位等，使用影像学手段要做到准确地判断胰腺占位性质往往非常困难。尽管近几年超声内镜引导下细针穿刺活检(EUS-FNA)为部分患者解决了这一诊断难题[6]，但这是一种侵袭性操作，有时由于病灶周围主要血管的原因，解剖学上难以接近胰腺肿块。另外在EUS-FNA的操作过程中还存在癌细胞播散风险。为了改善预后，迫切需要寻找一种临床应用方便的、微创的和对早期诊断有较大价值的胰腺癌诊断方法。

1 DNA甲基化与胰腺癌

目前许多研究已经证明异常的DNA甲基化是多种肿瘤发生的早期事件，不同种类的肿瘤显示一个或多个基因的异常甲基化(表1)[5]。研究者们针对胰腺癌的DNA异常甲基化也做了大量的研究，还深入探讨了它们在胰腺癌早期诊断中的效用。Yi等[7]发现了ADAMTS1与BNC1基因在胰腺癌细胞中的异常甲基化，还发现BNC1甲基化阳性率随着胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)的等级增加而增加。同时Sato与Fukushima等[8-10]的多项研究显示以CDH3为首的9个基因甲基化阳性率也有这一现象，在胰腺癌细胞中这些基因的异常甲基化更为频繁，其中UCHL甲基化阳性率达100%。Ginestà等[11]有试验证明HRH2、EN1、SPARC、CDH13、APC中两个或多个启动子高甲基化对胰腺癌有诊断意义。杨卫华等[12]研究表明p16基因启动子区甲基化异常水平与胰腺癌组织分化程度、有无转移、PTMN分期有关。Parsi 等[13]通过定量甲基化特异性聚合酶链反应(quantitative methylation specific PCR,QMSP)检测了胆道或/和胰管狭窄患者的内窥镜刷取样本，发现NPTX2、TFPI-2、cyclin D2基因的甲基化状态可以鉴别胰腺癌、其他壶腹部周围癌、良性壶腹周围疾病。Park等[14]也指出胰腺癌细胞学样本的NPTX2甲基化检测比病理学检测敏感度更好。除基因异常高甲基化之外，异常低甲基化也可通过上调癌基因的表达参与肿瘤的发生发展。Yokoyama等[15]的研究结果显示胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中MUC1 和 MUC4 的启动子区域存在DNA 异常低甲基化。还有研究[16-18]发现MUC4启动子的低甲基化在PDAC和PanIN-H细胞中的频率显著高于PanIN-L和正常胰腺细胞。Sato等[19]在5种胰腺癌细胞株中也发现MMP-2、MMP-7和MMP-9基因呈低甲基化状态。这些研究提供了PanIN-PDAC进展模型中多种基因异常甲基化频率增加的证据，同时癌症基因组图谱和国际癌症基因组联盟已经为包括胰腺癌在内的25种癌症类型的数千个肿瘤样本生成了甲基化基因组数据[20-22]。DNA甲基化检测不仅有助于胰腺癌的早期诊断，或许还能在胰腺癌的一级预防中发挥一定的作用。因此，需要选取一种易获取、准确性高的标本用于DNA甲基化检测，包含循环游离DNA(cell free DNA，cfDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)在内的液体活检技术作为一种新兴技术为研究者们提供了新思路。

表1 人类癌症中常见的甲基化基因及其在肿瘤发展中的作用

2 cfDNA甲基化与胰腺癌

cfDNA最初是指游离于细胞外的DNA片段，存在于血浆、血清以及其他体液中，长度100～300 bp，它可以是正常组织细胞释放的DNA片段，也可以是肿瘤细胞或者其转移灶释放出的含有肿瘤异常DNA信息的片段，因此也被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。正常人体循环中含的cfDNA非常低，超过90%的人每毫升血浆中不超过25 ng，而肿瘤患者可以达到数倍。尤为重要的是，ctDNA中包含有大量与肿瘤有关的信息，如癌基因的突变，与肿瘤发生有关的细胞信号通路的异常和遗传表观修饰的异常等。因此，通过检测ctDNA与CTC，能够早期、高敏感、高特异诊断肿瘤并提供精准医疗的信息，它们一起被称为肿瘤的液体活检技术。

有很多学者都探索了cfDNA甲基化异常对胰腺癌诊断的价值，初步的结果是令人振奋的。Kisiel等[23]利用检测粪便中DNA的甲基化异常标志来诊断胰腺癌。Thompson等[24]通过分析胰腺癌患者的甲基化异常特征发现，胰腺癌组织甲基化异常与患者生存率密切相关。Kisiel等[25]甚至还通过甲基化特异性PCR的办法对胰液中的CD1D、KCNK12、CLEC11A、NDRG4、IKZF1、PKRCB, 以及KRAS等多个胰腺癌相关的标志物位点甲基化做了检测，结果发现以CD1D为首的标志物甲基化异常对胰腺癌诊断有特别的价值。Yi等[7]针对胰腺癌患者的血清标本进行了分析，结果显示BNC1、ADAMTS1两种基因一起用于胰腺癌早期诊断时的敏感度和特异度达81%、85%。Neale等[26]利用 Methy Light QMSP的方法通过研究白细胞中LINE-1、Alu and Sat2 DNA重复原件结果，发现其过度甲基化可用于诊断胰腺癌，且其中LINE-1与胰腺癌危险度密切相关。因此，cfDNA及其甲基化异常的检测能够成为一种非常有潜力的诊断手段。

3 胰液cfDNA甲基化与胰腺癌

目前发表的文献中选取的标本有血浆、白细胞、粪便、胰液以及肿瘤组织等。从标本的获得性来讲，粪便和血液最易获得，而肿瘤组织最为困难。从准确性和最能反映肿瘤细胞的特征性角度讲，肿瘤组织最佳，胰液次之，而血液和粪便更易受其他组织器官的干扰。因此。作者认为选取相对容易获得且直接来源于胰腺的胰液最为合适。Ginesta等[27]对85例胰腺癌、26例壶腹癌、10例胰腺导管内乳头状黏液肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、14例慢性胰腺炎患者的135份胰液进行了甲基化特异性熔解曲线分析，发现APC甲基化作为一个单独的检测标志来识别胰腺癌有很好的性能，其敏感度达71%，特异度达93%。在考虑所有肿瘤时，APC敏感度仍然很高(73%)。还有研究[28]指出检测胰液样本中MUC1、MUC2和MUC4启动子的DNA甲基化水平可以区分胃型IPMN、肠型IPMN、其他型IPMN和PDAC。重要的是，在小胰腺癌(直径<2 cm)患者的胰液样本中也检测到异常甲基化的DNA[10]。Matsubayashi等[29-30]与Yao等[31]的研究也表明了胰液的DNA甲基化检测对胰腺癌、IPMN、慢性胰腺炎有良好的鉴别能力。两项试验都进一步通过QMSP对基因的甲基化进行了量化分析，发现检测的敏感度比正常MSP更好。Nishizawa等[32]对比了胰液、常规活检样本与EUS-FNA细胞学样本的CDO1启动子甲基化情况，结果发现胰液检测胰腺癌的灵敏度达95%，明显高于常规活检样本(33%)和EUS-FNA细胞学样本(88%)。上述从胰液中提取cfDNA的研究中发现诸多异常甲基化的基因，并且对于诊断胰腺癌的敏感度、特异度尚佳。而获取胰液的方式多种，Sato 等[9]的研究是直接从横切的胰管中抽吸的胰液，Kisiel等[25]则是对患者静脉注射促胰液素16 mg后通过十二指肠腔抽吸术收集的胰液，也有研究[29-30]是通过ERCP回收的胰液。现在内镜技术非常发达，通过ERCP获得胰液标本相对微创、准确，若留置鼻胰引流管(如果患者合并胆胰管梗阻)，还可以多次获得标本用于评价治疗效果和随访等。

4 总结

胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其早期缺乏特异性症状，以及肿瘤的高生物攻击性和抗细胞毒性药物，都导致了胰腺癌的高致死率。为了改善胰腺癌的预后，人们对早期诊断的需求越来越高，因此迫切需要寻找一种早期诊断的新途径。对胰腺癌的分子流行病学的研究[33]表明，从癌前病变到癌症，从早期癌症到晚期癌症的进展速度较慢。这一间隔时间为发现癌前病变和早期的胰腺癌提供了机会。目前已在胰腺癌患者的胰液样本中发现多种异常甲基化的基因，在其癌前病变中也有类似发现，例如PanIN患者、IPMN患者，这些基因无论是单独的还是组合的，都有研究支持其作为胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。但是其中一部分基因的异常甲基化在其他肿瘤中也有被检测到。另外，正常组织中也存在低水平的DNA甲基化，并且对于某些基因，其阳性频率会随着年龄的增长而升高[30]。因此，仍需要大量的研究及实验来推动胰液中cfDNA甲基化检测在胰腺癌早期诊断中的应用。

作者贡献声明：周艳负责课题设计，收集并分析资料，撰写及修改论文；宁波负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。