抗犬细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

杨凯越，宋彩玲，李彤彤，王文静，陈慧宇，赵爽爽，刘明

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)

犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科细小病毒属成员，是引起幼犬严重肠胃炎的主要病原之一，特别是没有免疫的幼犬或者没有母源抗体的幼犬更易感染犬细小病毒病[1-2]。该病毒在1977年首次从患有出血性肠炎的病犬粪便中观察到，1978年便从患有肠炎的病犬体内分离得到，随后在世界各地的犬科动物中相继被发现[3-4]。病犬以剧烈呕吐、腹泻、白细胞显著减少为主要特征，且该病一年四季均可发生[5]。

犬细小病毒病自暴发以来，因其高致病率和高死亡率，给养犬业、经济动物养殖业造成了严重的影响，也危害了野生动物的生存，因此开展对CPV感染诊断防治方面的研究至关重要。单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAb)因其高特异性和高均一性已经在疾病的诊断和治疗中被广泛应用[6-7]。抗CPV 的MAb已成为治疗和诊断犬细小病毒病的主要工具之一。本试验制备了抗CPV MAb，并对获得的MAb进行了效价、中和活性和亚类方面的鉴定，筛选到了3株效价较高、特异性较好的杂交瘤细胞株，为犬细小病毒病的诊断、治疗及后续研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

毒株CPV-YN由本实验室分离鉴定，pCI-NS和pCI-VP1表达质粒由本实验室构建，SP2/0骨髓瘤细胞和F81细胞由本实验室保存；DMEM培养基、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、HAT、HT、50% PEG、山羊抗小鼠IgG-FITC和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)均购自Sigma公司；CPV单克隆抗体购自北京金百奥生物技术有限公司；胎牛血清购自BIOCHROM公司；NAbTM纯化柱购自GE公司；6～8周龄SPF BALB/c小鼠购自北京维通利华试验动物技术有限公司。

1.2 动物免疫

将CPV接种于生长状态良好的F81细胞，进行CPV的扩增培养，4～5 d当细胞病变(CPE)达到80%时收取细胞培养上清病毒液并将其反复冻融3次。将收取的500 mL病毒液通过超速离心浓缩到5 mL，作为免疫小鼠的免疫原。

初次免疫为CPV与完全弗氏佐剂等量混合乳化，腹腔注射0.2 mL/只。二免、三免为CPV与不完全弗氏佐剂乳化，剂量与初次免疫剂量相同，时间间隔2周，三免7 d后断尾采血，采用间接ELISA检测小鼠血清效价。将效价高的小鼠融合前3 d用CPV腹腔注射0.2 mL/只加强免疫。

1.3 间接ELISA筛选方法的建立

以纯化浓缩的CPV作为包被抗原，未免疫小鼠血清作为阴性对照，免疫小鼠血清作为阳性对照，优化间接ELISA反应条件，建立间接ELISA筛选方法。

1.4 细胞融合与培养

取加强免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞在50% PEG的作用下进行细胞融合，融合后接种于饲养层细胞中，在37 ℃、5% CO2的条件下用HAT培养基进行选择性培养。

1.5 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，直至能筛选到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，将其扩大培养并冻存。

1.6 MAb腹水制备及抗体纯化

将灭菌石蜡油以0.5 mL/只的剂量注射10周龄雌性BALB/c小鼠，7 d后腹腔注射阳性杂交瘤细胞约5×106个，待小鼠腹腔明显胀大后收集腹水，离心收集上清，采用亲和层析方法纯化腹水，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度。

1.7 MAb的中和活性鉴定

将病毒浓度稀释到200TCID50，与3株单抗倍比稀释的腹水、细胞上清等体积混合，37 ℃、5% CO2的条件下孵育1 h，然后接种F81细胞，100 μL/孔，做4个平行重复，同时设置只加培养基、只加病毒液的细胞孔作为阴性对照和阳性对照，培养4～5 d观察细胞的CPE情况，检测MAb的中和活性。

1.8 MAb的鉴定

1.8.1 效价的测定

采用间接ELISA方法分别测定杂交瘤细胞上清、单克隆抗体腹水的抗体效价。

1.8.2 染色体数目的测定

在对数生长的杂交瘤细胞中加入秋水仙素溶液，使其终浓度为0.4 μg/mL，37 ℃培养4～6 h，离心弃上清，0.075 mol/L KCl低渗处理细胞30 min，经固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)反复固定离心后，留取0.5～1 mL固定液重悬细胞，将细胞悬液滴在预冷载玻片上，10% Giemsa染液染色，镜检进行染色体计数。

1.8.3 亚型鉴定

按照免疫球蛋白分型检测试剂盒说明书进行MAb亚类测定。

1.8.4 间接免疫荧光鉴定(IFA)

将CPV接种至单层F81细胞中，37 ℃培养24 h，经甲醛固定细胞，Triton X-100处理后，加入单克隆抗体腹水(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，洗涤后加入山羊抗小鼠FITC-IgG(1∶250)37 ℃避光孵育2 h。同时设立未接种CPV的细胞作为阴性对照，以商品化CPV单克隆抗体孵育接种CPV的细胞当作阳性对照，荧光显微镜观察试验结果。

1.8.5 MAb抗病毒蛋白的鉴定

将本实验室构建的pCI-NS和pCI-VP1表达质粒分别转染F81细胞，37 ℃、5% CO2的条件下培养24 h，以1D9、3G9和4F6的细胞培养上清作为一抗，山羊抗小鼠FITC-IgG作为二抗进行IFA检测，同时设立以转染空载体pCI-Neo的细胞孔作为阴性对照，测定杂交瘤细胞株具体识别的CPV蛋白种类。

1.8.6 交叉反应性分析

将犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、犬腺病毒2型(CAV2)和CPV分别包被酶标板，分别以相应的阴性、阳性血清作为阴、阳性对照验证病毒是否包板成功。以本研究获得的单克隆抗体作为一抗进行间接ELISA，判定单克隆抗体与常见病毒的交叉反应性。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA检测方法的建立

经过反应条件的优化，最终确定最佳的抗原包被浓度为 1∶100稀释，37 ℃包被2 h；一抗反应条件为1∶100倍稀释，37 ℃反应1 h；IgG-HRP反应条件为1∶5 000稀释，37 ℃避光反应45 min；底物最佳反应时间为10 min。

2.2 亚类鉴定

经过3次亚克隆，获得3株单抗，分别命名为1D9、3G9和4F6。亚类鉴定结果显示，1D9和3G9重链为IgG1，4F6重链为IgG2b，轻链均为kappa链。

2.3 腹水抗体的纯化

将纯化的抗体进行SDS-PAGE分析，结果如图1，抗体重链大小为50 kDa左右，轻链大小为25 kDa左右。

M.预染蛋白Marker；1.1D9；2.3G9；3.4F6

2.4 效价测定

1D9、3G9和4F6单抗细胞培养上清效价分别为1∶64、1∶64和1∶128，腹水效价为1∶104、1∶104和1∶105。

2.5 染色体计数

1D9、3G9和4F6染色体数分别为92、94和98(如图2)，均接近脾细胞(40)与骨髓瘤细胞(68)的染色体数目之和，表明本研究制备的3株单抗是2种细胞融合的产物。

A.1D9杂交瘤细胞；B.3G9杂交瘤细胞；C.4F6杂交瘤细胞

2.6 间接免疫荧光试验

本试验制备的3株单抗均可与感染CPV的F81细胞反应，出现绿色荧光(如图3)，与阳性对照结果一致，而与未接种CPV的F81细胞不发生反应。

A.1D9与感染CPV的F81细胞反应；B.3G9与感染CPV的F81细胞反应；C.4F6与感染CPV的F81细胞反应；D.阴性对照；E.阳性对照。标尺=400 μm

2.7 MAb的病毒蛋白识别分析

将pCI-NS、pCI-VP1表达质粒以及空载体pCI-Neo分别转染F81细胞，进行IFA检测，结果显示如图4。转染了pCI-VP1细胞孔均能看到绿色荧光，而3株单抗与转染了pCI-NS和空载体的细胞孔均无绿色荧光出现，表明杂交瘤细胞株1D9、3G9和4F6产生的单克隆抗体针对的是CPV的VP蛋白。

A.1D9与转染pCI-VP1的F81反应；B.1D9与转染pCI-NS的F81反应；C.1D9与转染pCI-Neo的F81反应；D.3G9与转染pCI-VP1的F81反应；E.3G9与转染pCI-NS的F81反应；F.3G9与转染pCI-Neo的F81反应；G.4F6与转染pCI-VP1的F81反应；H.4F6与转染pCI-NS的F81反应；I.4F6与转染pCI-Neo的F81反应。标尺=400 μm

2.8 特异性试验

包被CDV、CCV、CAV和CPV的酶标孔与相应的阴、阳性血清反应后，P/N均大于2.1，说明病毒已成功包被。间接ELISA结果(表1)显示，3株单抗只与CPV发生反应，与CDV、CCV和CAV2均不发生反应，证明本研究制备的单克隆抗体与其他犬类病毒无交叉反应，特异性良好。

表1 交叉反应试验结果

2.9 MAb的中和活性鉴定

中和试验结果表明，杂交瘤细胞株4F6细胞上清稀释16倍、腹水稀释512倍时细胞未出现CPE，将其继续稀释时，出现CPE。杂交瘤细胞株4F6细胞培养上清完全中和效价为1∶16，腹水完全中和效价为1∶512。而1D9和3G9分泌的抗体不能阻止细胞发生CPE，不具有中和活性。

3 讨论

单克隆抗体作为现代免疫学的重要工具之一，已广泛应用于病原检测、治疗、致病机制及抗原性研究等方面[8]。单克隆抗体制备的整个过程涉及到动物免疫、细胞融合、筛选等多个步骤。免疫环节是单抗成功制备的关键[9]。免疫原的纯度直接影响免疫效果，高纯度的抗原可以提高杂交瘤细胞的阳性率，有利于获得所需的抗体。本研究采用纯化浓缩的CPV作为免疫原进行免疫，共获得3株效价较高、特异性较好的单克隆抗体。而且其中1株具有中和活性，具有中和活性抗体的获得可能与免疫原的纯化有关。

目前对于患病动物的治疗临床上主要采用高免血清或单克隆抗体进行治疗。相比于高免血清，单克隆抗体具有效价高、特异性好、可以规模化生产等优点，对病毒感染的针对性治疗具有较好的实用价值[10]。本研究获得的单克隆抗体4F6具有中和活性，可应用于疾病的治疗。在诊断方面，常用的实验室诊断方法虽然敏感特异，但需要专业人员的专业操作，不适用于临床诊断中[11]。胶体金检测技术具有简单、快速、直观等优点。王中力等[12]利用胶体金溶液标记已纯化的CPV单克隆抗体，组装胶体金免疫层析试纸条，检测样品效果良好。本研究制备的3株单克隆抗体亚类鉴定均属于IgG类，将有利于胶体金标记抗体和质控线包被抗体的选择，为建立相应的免疫学检测方法提供了基础。