小反刍兽疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

孙雨，宋晓晖，肖颖，王睿男，李秀梅，任雪建，李雪刚，魏巍，杨林，王传彬*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 大兴 102600；2.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 400000；3.洛阳现代生物技术研究院有限公司，河南 洛阳 471000；4.登封市畜牧业服务中心，河南 登封 452470)

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)，又称“羊瘟”，是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种急性高热、高度接触传染性疾病，主要感染小反刍动物，如山羊、绵羊、羚羊、美国白尾鹿等，其中以山羊最为严重，易感羊群的发病率和死亡率可达100%[1]。进入20世纪以来，在非洲利比亚、尼日利亚，以及中国、巴基斯坦等亚洲多地均有发生过PPR的报道[2-4]。目前尚无有效药物治疗PPR，对该病的成功控制策略主要依赖于疫苗免疫，而PPRV抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法[5]。目前现有的标准诊断技术主要包括病毒分离鉴定、PCR以及竞争ELISA抗体检测方法等。最近几年，PPR诊断技术在国内外已有大量研究报道，相继建立了多种检测PPRV的新型方法，主要包括荧光免疫血清学方法和实时荧光定量PCR检测方法等[6-8]。病毒的分离鉴定与血清中和试验是OIE诊断PPRV的金标准，这2个方法虽然较为准确，但需要耗费约几天的时间才能获得结果，并且操作技术复杂，生物安全要求高，不适用于基层兽医快速诊断需求。反转录PCR和实时定量PCR已经广泛用于检测PPRV，但这2种方法需要专业人员在专业的实验室内开展，也给基层检测人员诊断PPR带来了一定的困难。血清学检测主要以ELISA为主，检测稳定性与特异性具有一定的局限性。本研究建立的化学发光免疫分析方法采用竞争原理，将PPRV的N蛋白作为包被抗原，包被于化学发光酶标板上，待检血清与酶标单抗同时加入到化学发光酶标板中，二者竞争性地与N蛋白上的相应表位结合，最后加入化学发光底物，读取发光值，从而计算出动物血清中PPRV抗体含量，并判断阴阳性结果。由检测结果判定被检动物体内的PPRV抗体含量，具有较高的实用价值和推广价值。

1 材料与方法

1.1 材料

PPRV N融合蛋白抗原由中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)制备保存；进口PPRV抗体ELISA检测试剂盒购自法国IDVET公司；脱脂奶粉购自美国Oxoid公司；鲁米诺化学发光底物，购自洛阳现代生物技术研究院有限公司；化学发光酶标板，购自美国Thermo公司；10%的胎牛血清、细胞培养基与相关细胞培养试剂购自美国Gibco公司；阴性与阳性样本血清由中国动物疫病预防控制中心(农业农村部兽医诊断中心)保存。

1.2 PPRV单克隆抗体的制备及纯化

1.2.1 杂交瘤细胞繁殖

将生产用细胞株2E5C4(中国动物疫病预防控制中心菌毒种保藏室保存)，用含有15%胎牛血清的高糖型DMEM培养液(pH=7.0)制成细胞悬液，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养，48～72 h，细胞能够稳定分裂繁殖，可长成单层。

1.2.2 小鼠腹水制备

选取12～16周龄健康雄性BALB/c小鼠，按0.5 mL/只腹腔注射弗氏不完全佐剂，7～10 d后每只小鼠腹腔接种l×106～5×106个2E5C4株杂交瘤细胞，经7～10 d后可见小鼠腹部明显膨大，无菌操作采集腹水。采集的腹水以8 000 r/min离心10 min，弃去上层脂肪层，收集中层腹水，-70 ℃冻存备用。

1.2.3 单克隆抗体的纯化

采用辛酸饱和硫酸铵沉淀法，对制备的含有单克隆抗体的腹水进行纯化，纯化后的单克隆抗体无菌定量分装，-20 ℃以下保存备用。

1.2.4 单克隆抗体HRP标记

称取2 mg HRP溶解于0.5 mL蒸馏水中，加入0.5 mL新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，4 ℃避光30 min。加入160 mmol/L的乙二醇 0.5 mL，室温放置30 min。加入纯化的单抗2 mg，混匀。将上述溶液装入透析袋中，置2 000 mL的PBS(pH=7.0)缓冲液中透析，4 ℃搅拌过夜。透析液吸至15 mL的离心管中，加0.2 mL新配的5 mg/mL NaBH4液，混匀，4 ℃放置12 h。将得到的产物用分子筛进行层析，将未和单抗结合的辣根过氧化物酶去除。

1.2.5 酶结合物的制备

将制备的浓度为1 mg/mL酶标单克隆抗体用酶结合物稀释液按1∶8 000稀释，搅拌均匀，无菌分装，12 mL/瓶，置2～8 ℃保存。

1.3 样本采集及处理

采集静脉血时，每头猪、牛或羊使用一个注射器。进行静脉无菌采血，不少于2 mL。倾斜放置于室温中静置2～4 h，待血液自然析出血清，必要时可低速离心(3 000 r/min离心10～15 min)，分离血清。

1.4 化学发光检测步骤

①包被：将N重组蛋白用包被缓冲液稀释到1.5 μg/mL，以100 μL/孔的量加入化学发光酶标板中，置2～8 ℃包被16 h。②洗板：弃去包被液，将25倍浓缩洗涤液稀释成1倍洗涤液，用(280±20)μL洗涤液洗涤板孔，洗板2次，每次洗涤后应弃去孔内的液体，最后1次洗涤液弃去后，将包被板在吸水纸上拍干，直至孔内无残留洗涤液。③封闭：每孔加入150 μL封闭液，置于37 ℃封闭2 h，弃去封闭液，在吸水纸上拍干。④干燥：置于37 ℃干燥3～5 h，将包被板装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于冰箱2～8 ℃保存备用。⑤样品稀释：在血清稀释板中，用样品稀释液将待检样品按照1∶20比例进行稀释。⑥加样：取出包被板，每次试验需设置系列校准品6孔。首先在血清稀释板上依次加入校准品1～6各60 μL，其余各孔依次加入待检样品各60 μL，再向以上各孔均加入60 μL 酶结合物，震荡混匀。每孔吸取100 μL转移至包被板对应孔内。⑦温育：置37 ℃恒温培养箱中温育(30±1)min。⑧洗板：将各孔的液体弃入废液筒，用(280±20)μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次，每次洗涤后应弃去孔内的液体，最后1次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。⑨加入底物：每孔各加入100 μL的鲁米诺化学发光底物，振荡混匀。⑩静置：在15～25 ℃条件下避光静置5 min，静置后15 min内用化学发光仪读取发光值。

结果计算方法：以校准品1至校准品6的发光值为纵坐标，对应的抗体剂量值(0、10、20、50、100、200 NCU/mL)为横坐标，通过ELISACalc软件绘制校准品的四参数拟合曲线，四参数模式为Y=(a-b)/[1+(x/c)*b]+d。将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中抗体的含量。

1.5 试验成立条件与结果判定

将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合，R2≥0.99，试验成立;否则，试验不成立。如果待测样品中抗体含量<临界值40 NCU/mL，样品应判定为PPRV抗体阴性；如果样品中抗体含量≥临界值40 NCU/mL，则判定为PPRV抗体阳性。

1.6 质控血清的检测

采用化学发光免疫分析检测方法，对12份质控血清(其中强阳性血清3份，阳性血清3份，弱阳性血清3份，阴性血清3份)进行检测，重复3次，并用进口的PPRV抗体ELISA检测试剂盒作为对照，比较2种检测方法对质控样本的检出率。

1.7 交叉试验

采用O型口蹄疫病毒阳性血清、羊痘病毒阳性血清、羊口疮病毒阳性血清、布鲁菌阳性血清和大肠杆菌阳性血清，进行血清中和试验验证PPRV抗体为阴性后，用建立的化学发光方法对上述血清进行检测，判断是否具有交叉反应。

1.8 最低检出量试验

将PPRV敏感性阳性质控血清按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1 024、1∶2 048进行倍比稀释，采用化学发光免疫分析检测方法与进口的PPRV抗体ELISA检测试剂盒同时对上述血清进行检测，重复3次。

1.9 重复性试验

采用建立的化学发光免疫分析检测方法对12份经过鉴定的阳性血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数。

1.10 符合性试验

采用建立的化学发光免疫分析检测方法与进口的PPRV抗体ELISA检测试剂盒对送检的338份血清进行检测，计算其符合率。

1.11 数据统计与分析

试验数据经SPSS 18.0进行统计分析，结果用“平均值±标准误”表示，并计算变异系数。变异系数=(标准偏差/平均值)× 100%。

2 结果与分析

2.1 PPRV单克隆抗体的制备与纯化分析

SDS-PAGE检测发现在55与27 kDa处分别出现PPRV单克隆抗体重链与轻链的目的条带，表明试验成功制备了针对PPRV的单克隆抗体，且纯化后的单克隆抗体纯度在90%以上，结果见图1。

M.蛋白质分子质量标准；1.PPRV单克隆抗体(小鼠腹水)

2.2 质控血清检测

采用化学发光免疫分析检测方法，对12份质控血清进行检测，重复3次，检测结果显示该检测方法的3次重复试验和进口检测试剂盒的阳性检出率均为100%，见表1。

表1 化学发光免疫分析检测方法对质控血清的检测结果

2.3 交叉试验

用建立的化学发光免疫分析检测方法对交叉试验对照血清进行检测，结果全部为阴性，见表2。

表2 化学发光免疫分析检测方法交叉试验

2.4 最低检出量试验

将阳性质控血清进行倍比稀释，采用化学发光免疫分析检测方法对上述血清进行检测。结果表明进口PPRV ELISA抗体检测试剂盒对阳性质控血清检测最低稀释度为1∶512，化学发光免疫分析检测试剂盒最低检出量为1∶1 024，说明该检测方法的敏感性优于进口ELISA检测方法。结果见表3。

表3 化学发光免疫分析检测方法最低检出量试验

2.5 重复性试验

采用建立的快速定量检测方法对12份血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数。结果表明，本试验建立的化学发光方法批内重复系数均小于10%，批间重复系数均小于15%，该方法具有良好的重复性。结果详见表4。

表4 化学发光免疫分析检测方法重复性试验

2.6 符合性试验

选择抽取338份样本，使用本研究建立的PPRV抗体化学发光免疫分析检测方法与进口的PPRV ELISA抗体检测试剂盒进行比对。检测结果显示，2种方法的总符合率为90.33%，阳性符合率为95.02%，阴性符合率为82.08%。结果见表5。

表5 符合率统计

3 讨论

PPRV感染能力强，传播途径多，其引起的PPR在多个国家和地区发生过大范围流行，严重阻碍了养羊业的发展。该病一旦发生，会给养殖户经济造成重大损失，因而及时快速诊断十分重要[1,5]。目前我国现有的PPRV检测国标《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)主要涉及PPRV的分离鉴定、血清中和试验、病毒核酸的分子生物学检测方法以及病毒抗体的ELISA检测方法[5-6]。但病毒分离鉴定、血清中和试验、病毒核酸的分子生物学检测方法的局限性在于对实验室条件和人员操作水平有较高的要求，检测速度相对较慢。在血清学检测方面，ELISA方法作为传统的检测技术之一，各级实验室普及性较高，但检测稳定性与特异性具有一定的局限性。近年来国内外学者依据病毒的N、H和F等特异保守抗原建立了多种ELISA检测技术，例如C-ELISA、I-ELISA等检测方法，在敏感性与特异性方面取得了一些进展[9-11]。而化学发光免疫分析检测方法与传统ELISA对比，两者操作步骤、检测速度相近，但化学发光方法的优越之处在于发光底物的灵敏性更好[12]。在人类医学诊断检测方面，已经成功建立了化学发光免疫分析法用于检测乙肝病毒感染标志物等多项成熟的技术，无论检测的敏感性与特异性都明显优于传统ELISA方法[13]。

化学发光免疫分析方法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。该方法将抗原、抗体同样本结合，而有的化学发光免疫分析检测方法由磁珠捕捉形成反应物，然后再加入发光促进剂，加大反应物自发光速度和强度，用发光信号测量仪测量光子数量进行定量分析。化学发光免疫分析检测方法是继放免分析、传统酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的又一项新型的酶免疫分析检测技术。化学发光方法精确度高，无污染，检测速度快，技术日益成熟，代表了免疫诊断的发展方向[14]。目前尚没有敏感性与特异性更高的PPRV抗体化学发光免疫分析检测方法见于国内外文献报道之中。本研究使用了PPRV N蛋白作为包被抗原，纯化并标记针对N抗原的单克隆抗体建立了PPRV抗体化学发光免疫分析检测方法。与市售的PPRV抗体ELISA检测试剂盒相比，本研究建立的化学发光检测方法，在保证检测特异性的同时，灵敏度方面比市售ELISA试剂盒更为敏感，阳性血清样品检出率也更高，并且可以实现抗体的定量检测，所以检测性能方面更具优势，具有较好的市场应用前景。

综上，本研究建立的PPRV抗体化学发光检测方法敏感性高，特异性强，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对PPRV血清抗体的快速定量检测，为PPR的防控和净化提供了重要技术手段。