GADD45a、PI3K和p-p38在结直肠癌中的表达及临床意义＊

涂琦 ，杨军平 ，杨小军 ，周建 ，曹丽华

（江西中医药大学附属医院，1.病理科；2.检验科，南昌 330006）

结直肠癌是最常见的消化系统肿瘤之一，发现时常常处于中晚期， 预后不佳。 目前的研究表明，包括GADD45a 在内的多种通道的激活可抑制结直肠癌细胞的增殖，但机制不明。此前的研究中,发现PI3K-AKT 信号通路参与调控GADD45a[1]。为明确结直肠癌中PI3K-AKT 信号通路中GADD45a作用机制，选择PI3K-AKT-GADD45a 信号通路关键分子PI3K、p-p38， 使用免疫组织化学的方法检测结直肠癌、 正常肠黏膜组织中GADD45a、PI3K和p-p38 的表达， 探讨三者与结直肠癌临床病理特征的关系及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集 2009 年 1 月-2014 年 12 月江西中医药大学附属医院病理科123 例结直肠癌标本， 另选取基本正常结直肠黏膜组织60 例作为对照。 根据WHO（2010）消化系统肿瘤分类标准进行分类， 由两位资深病理医师经双盲法重新阅片诊断。 患者男 65 例，女 58 例；年龄 26-83 岁，平均59.65 岁；肿瘤直径＜5cm 者 87 例，≥5cm 者 36 例；分化程度：高分化12 例，中分化93 例，低分化18例； 淋巴结转移者54 例， 无淋巴结转移者69 例。TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期 66 例， Ⅲ+Ⅳ期 57 例。 纳入标准:⑴术前均未接受放、化疗；⑵有完整的临床和随访资料（随访截止日期2019 年12 月30 日）。

1.2 试剂 GADD45a 多克隆抗体（D122400，上海生工生物工程股份有限公司），PI3K(sc-1637，圣克鲁斯生物技术有限公司）、p-p38(sc-7973，圣克鲁斯生物技术有限公司），CFDA 免疫组化检测试剂盒（GK6007）购自基因科技有限公司。

1.3 免疫组织化学 ⑴组织芯片制作：从123 例结直肠癌和60 例基本正常结直肠黏膜组织对照HE切片选取1mm 圆柱形组织， 将其放入空白蜡块孔中，55°C 温箱中烤 1h，完全融合后，室温冷却，备用切片。 ⑵采用EnliVision 法免疫组织化学染色：在123 例结直肠癌60 例正常结直肠黏膜组织中进行 GADD45a、PI3K、p-p38 免疫组织化学染色。使用防脱石蜡切片，切片经60°C 恒温烤箱中烤片2h；脱蜡、水化、消除内源性过氧化物酶，使用高压加热抗原修复法， 加一抗 GADD45a（1：30）、PI3K(1：50)、p-p38 (1：50)4°C 孵育过夜；PBS 冲洗除去PBS， 每滴加聚合物增强剂孵育20min，PBS 冲洗；二抗室温下孵育30min；DAB 溶液显色自来水冲洗1min，苏木素复染，分化、返蓝；脱水、透明、中性树胶封片；为防止出现假阳性和假阴性的可能，免疫组织化学实验采用阳性对照和采用空白对照和组织内对照作为阴性对照进行严格地质量控制。

1.4 结果判断 进行免疫组织化学染色判读GADD45a 主要表达于细胞核，PI3K 阳性为细胞质和/或细胞核;p-p38 表达于细胞核和/或细胞质。 参照Takebayashi 标准， 每张切片先在低倍镜（x100）下观察，表达较强的区域，再切换至高倍镜（x200）下观察， 选取3 个高倍视野， 计算阳性细胞百分比，参考半定量积分法，对结果进行评判：⑴按照切片中阳性细胞百分比记分：阳性细胞数为阴性，记0 分；阳性细胞数为l%-10%，记1 分；阳性细胞数为11%-50%，记2 分；阳性细胞数为51%-75%，记 3 分,阳性细胞数为＞75%，记 4 分;⑵再根据细胞染色的强弱记分：与背景色一致，阳性细胞几乎没有染色计0 分； 阳性强度染色比背景色略高为淡黄色计1 分；明显高于背景色为棕黄色计2 分；染色明显为棕褐色计3 分。 然后按照阳性细胞百分比×染色强弱计积分，≥3 分为阳性表达，＜3 分为阴性表达。

1.5 统计学分析 用SPSS 21.0 软件进行数据统计学分析，GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在结直肠癌和正常结直肠黏膜中的表达与临床病理学特征之间的关系分析采用χ2检验。 相关性检验采用Spearman 相关性分析。 单因素生存分析使用Kaplan-Meier 法，多因素生存分析采用Cox 风险回归模型分析，组间比较采用log-rank 检验。 P＜0.05有统计学意义，P＜0.01 具有显著的统计学意义。

2 结果

2.1 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白在结直肠癌、正常结直肠黏膜中的表达 结直肠癌组织中GADD45a 的表达水平低于正常结直肠黏膜组织，结直肠癌组织中PI3K 和p-p38 的表达水平高于正常结直肠黏膜组织，差异有显著性(P＜0.01)。 （表1，图1）

表1 GADD45a、PI3K 和p-p38 在结直肠癌与正常结直肠黏膜中的表达[n(%)]

图1 结直肠癌与正常结直肠黏膜中GADD45a、PI3K 和p-p38的表达，EnliVision 法:A GADD45a 在正常肠黏膜组织中呈阳性表达（IHC×200）；B PI3K 在正常结直肠黏膜中呈阴性表达（IHC×200）；C p-p38 在正常结直肠黏膜中呈阴性表达（IHC×200）；D GADD45a 在结直肠癌组织中呈阴性表达（IHC×200）；E PI3K 在结直肠癌组织中呈阳性表达（IHC×400）；F p-p38 在结直肠癌组织中呈阳性表达（IHC×400）

2.2 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表达与结直肠癌临床病理学特征相互关系 PI3K 的表达水平与结直肠癌淋巴结转移有无、肿瘤TNM 分期有相关性 （P ＜0.05）， 与 其 他 临 床 病 理 学 参 数 无 关 。GADD45a 和p-p38 的表达水平与临床病理学参数无关（P＞0.05）。 （表2）

2.3 结直肠癌中 GADD45a 与PI3K、p-p38 蛋白的表达及其相关性 GADD45a 阳性表达组中，PI3K阴性表达比例高于PI3K 阳性表达，但统计学无差异(P＞0.05)。 Spearman 相关分析显示，GADD45a 与p-p38 表达呈负相关(P＜0.05)（表3）。

2.4 生存分析 123 例结直肠癌患者中位生存时间为 60 个月， 平均 5 年生存率为 66.7%。 Kaplan-Meier 生存曲线显示，GADD45a 蛋白阳性表达的结直肠癌患者总生存时间高于GADD45a 蛋白阴性表达者，差异有统计学意义(P＜0.01，图2A)。 PI3K、p-p38 蛋白阳性表达的结直肠癌患者总生存时间分别低于蛋白PI3K、p-p38 阴性表达者，但差异无统计学意义(P＞0.05，图2B、2C)。 Cox 回归模型分析显示GADD45a 阴性表达、TNM 分期、 肿瘤大小是结直肠癌预后的独立危险因素（表4）。

表2 GADD45a、PI3K 和p-p38 蛋白表达与结直肠癌临床病理学特征相关性

表3 结直肠癌中GADD45a 与PI3K、p-p38 蛋白的表达及其相关性

3 讨论

结直肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，位列癌症相关死亡原因第四位， 死亡率占全部恶性肿瘤死亡率的8%[2]。 对临床而言，了解结直肠癌发生发展的分子机制有助于确定新的诊断和预后分子标志， 并能提供具有价值的临床治疗分子靶点，具有实现结直肠癌个体化诊治的重要意义。

生长阻滞和DNA 损伤基因 (growth arrest and DNA damage)于1988 年克隆自经紫外线照射后的中国仓鼠卵巢细胞[3]。GADD45a 基因位于1 号染色体 （1p31.2-p31.1） 编码一个分子量约18.4kDa 大小,具有165 个氨基酸的DNA 损伤诱导蛋白,其作用与DNA 损伤修复、 细胞凋亡、 信号转导有关。GADD45a 在多种肿瘤中出现表达改变, 乳腺癌表达较相应正常组织降低[4],非小细胞肺癌[5]表达未见明显差异,而在胰腺导管腺癌[6]中表达却增高。本实验中结直肠癌组织中GADD45a 的表达水平低于正常结直肠黏膜组织差异且有显著性统计学意义(P＜0.01)。 不同的肿瘤中，GADD45a 表达水平表现不同，可能与肿瘤形成和发展机制及GADD45a 在不同信号通路相互作用和交叉对话中起作用不同或与实验方法和样本选择不同有关。 在多种损伤因素如紫外线照射、电离辐射、烷化剂、营养缺失、化疗药物等作用下，GADD45a 可以依赖和非依赖p53 的方式表达上调。依赖P53 方式中，PI3K-AKT信号通路参与调控GADD45a，抑制AKT 的活性可诱导GADD45a 的基因表达[1]。 AKT 激活后可通过磷酸化作用激活或抑制下游的靶基因[7],包括：Casp ase9、NF-κB、mTOR、P21、FOXO3a 等。 FOXO3a 可激活下游组件GADD45a， 引起细胞G2/M 期生长阻滞[8]。在PI3K/Akt 信号通路选择性抑制剂的干扰下，肝癌细胞中sCLU 和Gadd45a 的表达无明显变化。 而Gadd45a 表达的调节可以影响Akt 的磷酸化水平[9]。 有研究发现，Myc 和 PI3K/AKT 协同抑制GADD45a 的表达[10]。 本实验中，GADD45a 阳性表达组中，PI3K 阴性表达比例高于PI3K 阳性表达，但统计学无差异(P＞0.05)。 此结果与多信号通路协同作用有关，或是与样本量有关需待进一步研究。

表4 结直肠癌患者预后多因素生存分析（n=123）

p38、ERK1/2、JNK 磷酸化已被证明能促进结直肠癌增殖、侵袭和转移[11]，cyclinD1 也被证明与结直肠癌发展和转移有关[12]。 本实验中，p-p38 在结直肠癌中的表达明显高于正常结直肠黏膜，证明p38 磷酸化与结直肠癌发生有关。

有研究发现，GADD45a 基因敲除细胞可显著降低细胞活力，加剧DNA 损伤，增加S 期阻滞，与p-p38、p-JNK 的显著激活有关，而与 p-ERK 无关[13]。 其发生机制可 能与 GADD45α 对 通过上 调PP2Cα 的表达，对 MKK-JNK/p38 /AP-1 通路的抑制作用有关[14]。 本实验通过Spearman 相关分析显示 GADD45a 与 p-p38 表达呈负相关 (P＜0.05)，可能与上述机制有关，需待相关实验证实。 p-p38 在结直肠癌中表达升高， 且被认为是预后差的危险因素[15]。 本实验中发现，p-p38 蛋白阳性表达的结直肠癌患者总生存时间低于p-p38 蛋白阴性表达者，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

在多种肿瘤中，GADD45a 与肿瘤预后相关，食管癌[16]、乳腺癌[4]GADD45a 阳性表达生存率高，GA DD45a 的高表达与AML 患者的DFS 中位数最低相关[17]。 本实验中Kaplan-Meier 生存曲线显示，GADD45a 蛋白阳性表达的结直肠癌患者总生存时间高于GADD45a 蛋白阴性表达者，差异有统计学意义(P＜0.01)。Cox 回归模型分析显示 GADD45a 阴性表达、TNM 分期、肿瘤大小是结直肠癌预后的独立危险因素。

综上所述，结直肠癌组织中GADD45a 的阴性表达可能与p-p38 激活有关，GADD45a 阴性表达是结直肠癌预后的危险因素,可作为结直肠癌预后潜在分子标志物。 本实验通过免疫组织化学的方法对 GADD45a、PI3K 和 p-p38 蛋白表达进行评估， 并对蛋白表达相关性及其临床意义进行初步观察和探讨， 今后需增加样本量并对其分子机制进行深入研究， 以揭示其分子机制。 深入研究GADD45a 在结直肠癌发生发展过程中的作用机制，对肿瘤监测、诊断、药物开发及预后等方面具有价值。