丙型肝炎肝硬化患者单核细胞促炎因子与抑炎因子的表达

张永萍 刘兰 张艳君

单核细胞在丙型肝炎(Chronic hepatitis C)持续感染和纤维化的过程中起着重要作用,单核细胞分泌的细胞因子与HCV感染的慢性化、持续的肝损伤及肝硬化的发生关系逐渐引起重视。机体T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞等免疫细胞在HCV感染后释放促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-12β和TGF-β及抗炎因子IL-10和IL-4[1-4],为了更清晰了解单核细胞促炎与抗炎细胞因子的分泌,排除外周血中其他单个核细胞释放细胞因子的干扰,本研究收集和分离患者外周血单核细胞,培养并检测其促炎因子和抗炎因子的表达,了解HCV相关肝硬化患者单核细胞促炎和抗炎细胞因子表达情况。

临床资料与方法

一、一般资料

选取新疆维吾尔自治区人民医院2016年1月至2017年5月因慢性丙肝肝硬化入住感染科的35例患者为丙肝组,诊断标准依据丙型肝炎防治指南(2015年版)[5],纳入标准(1)年龄18～60岁，男女不限。(2)HCV抗体阳性，HCV-RNA≥5.0×103IU/mL。(3)经肝脏B超或肝脏CT或肝脏核磁检查明确肝硬化。(4)Child评分A级。常规健康体检者18例为对照组。排除标准:(1)HAV、HBV、HDV、HEV和HIV重叠感染。(2)肝癌、酒精性及自身免疫性等其他肝病患者。(3)合并其他严重心、脑、肾、肺部疾患的患者。病例资料：丙肝组35例，其中男性19例，女性16例；年龄30～70岁，平均(53.86±12.03)岁。对照组18例，其中男性8例，女性10例；年龄25～70岁，平均(38.72±14.05)岁。两组年龄对比差异无统计学意义(P<0.05)。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均知情同意。并签署知情同意书。

就普通的小康家庭来说，其实大体就分为四块：衣食住行、保险、储蓄备用、投资创富。目前对中国的居民来说，主要有以下大类资产种类：股票、债券、货币、房地产、商品。每类资产又可以细分为很多子范畴，股票是股份有限公司在筹集资本时向出资人发行的股份凭证，是社会化大生产的产物。股票又可分为大盘股/小盘股；股票在交易市场上作为交易对象，同商品一样，有自己的市场行情和市场价格。由于股票价格要受到诸如公司经营状况、供求关系、银行利率、大众心理等多种因素的影响，其波动有很大的不确定性。正是这种不确定性，有可能使股票投资者遭受损失。价格波动的不确定性越大，投资风险也越大。因此，股票是一种高风险的金融产品。

二、研究方法

(一)HCV-RNA、常规生化及血常规指标检测

1.HCV-RNA的检测:采用实时RT-PCR法检测,试剂盒购自Liferiver公司,货号Z-HR-0008-02EX,严格按说明书规范操作。

其一，管理控制性。该特征主要指的是会计管理、报告管理职能以及企业对各项规章制度的监督与执行。其中，会计管理职能涉及对总账会计各项事务的记录、结算以及合并等相关工作。报告管理职能则包括企业盈利能力报告制定以及预算标准化报告编制等；其二，基础操作性。该特征主要包含账单发票管理、应收与应付账款管理职能等。其中，账单发票管理职能涉及对供需双方的账单数据质量予以检查与制作，并发送税务发票。应收与应付账款管理职能则包含数据处理、收付款票据管理以及合规审核等相关职能。其三，战略规划性。这一特征主要由现金流规划、战略投资规划、税收整体筹划以及投资预算等构成。

(二)单核细胞的分离及其细胞因子的表达测定

TNF-α:R:GTTGAGGGTGTCTGAAGGAG,F:AG GTCTACTTTGGGATCATTGC;IL-β:R:CGGAGATTC GTAGCTGGATG,F:GGATGACTTGTTCTTTGAAGCTG;IL-12β:R:CCAAGAACTTGCAGCTGAAGCCATT,F:GCAGAATGTCAGGGAGAAGTAG;IL-10:R:ATGCC CCAAGCTGAGAAC,F:GCCTTGCTCTTGTTTTCACAG;IL-4:R:CCTCTGTTCTTCCTGCTAGCA,F:GCCGTTT CAGGAATCGGATCA；TGF-β:R:GCCCTGGACAC CAACTATTGCF:GAAGTTGGCATGGTAGCCCTT。扩增条件:正反引物各0.5 μL,无RNA酶去离8 μL,cDNA 1 μL在RT-PCR仪上95 ℃,2 min；95 ℃,5 s,60 ℃,10 s,40个循环；熔解60～95 ℃,4 ℃延生。

2.常规生化及血常规指标检测:受试者晨起空腹采静脉血3 mL并于2 h内完成血常规、生化常规(ALT、AST、白蛋白、球蛋白、TG和总胆固醇)等指标检测。采用贝克曼AV5800全自动生化分析仪检测。

在HCV感染后,IL-10可以通过单核细胞产生[6],通过多靶点参与HCV的清除,首先介入调节HCV特异性的 CD8+ T细胞,主要是减少CD8+T细胞数量和损伤CD8+T细胞的分化[7]。同时,IL-10优先靶向TLR4信号通路[8],对来源于慢性丙型肝炎患者的单核细胞通过脂多糖(LPS)-TLR4信号路径生产更低的 TNF-α和IL-12[8]。IL-10抑制DC和巨噬细胞的功能,另外持续限制 Th1和Th2的效应反应。来自于巨噬细胞或DC的IL-10通过nTreg产生,这种情况下,使得免疫控制下的病原可处于长期的免疫逃逸和持续的感染[9]。在本次实验中丙肝组均为丙肝肝硬化患者,其单核细胞高表达IL-10,使得单核细胞HCV的清除能力下降甚至表现为耐受。因此难以清除HCV,导致HCV持续复制。也有文献报道在早期HCV感染的患者血清IL-10的高水平,与HCV感染的慢性化关系密切,且与HCV-RNA载量呈正相关[10]。高水平抗炎因子IL-10也减少促炎因子TNF-α的水平,TNF-α的水平的下降也预示着单核细胞功能的受损[11]。

2.单核细胞mRNA提取及细胞因子转录水平的测定:首先收集冻存单核细胞RNA、测定RNA浓度、冻存RNA备用。并反转录cDNA。目的基因及引物序列如下:

本文对生态视角下，我国村镇规划与发展的现状及其存在的问题进行了简要的分析，并提出了几点建议。增强我国村镇的生态性、传统性、特色性是我国存储规划发展的主要方向，既要注重经济发展也要实现环境保护，建设具有现代化特色的社会主义村镇，形成独有的发展特色。

实验组总清扫淋巴数量较对照组多，两组对比差异有统计学意义(P<0.05)；实验组Ⅰ～Ⅱ期清扫淋巴结数与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；实验组Ⅲ期清扫淋巴结数、淋巴结阳性数量较对照组多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

三、统计学分析

在控制年龄、性别、甘油三酯及总胆固醇等因素后,HCV-RNA载量与TNF-α、IL-1β、IL-12β、IL-10、IL-4及TGF-β行偏相关分析,HCV-RNA载量与TNF-α呈正相关(r=0.452,P=0.027);与IL-12β呈正相关(r=0.442,P=0.031),与IL-10呈负相关(r=-0.431,P=0.035),与TGF-β呈负相关(r=0.437,P=0.033),与IL-1β、IL-4不相关。见表3。

结 果

一、两组基本临床资料比较

ALT、AST、甘油三脂、总胆固醇、白细胞和血小板计数比较,其中ALT、AST、TG均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),白蛋白、白细胞和血小板两组比较均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组基本临床资料比较

二、两组单核细胞细胞因子表达情况

TNF-ɑ、IL-1β、IL-12β均高于对照组,差异无统计学意义(P>0.05),IL-4低于对照组,差异无统计学意义(P>0.05),IL-10、TGF-β高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

忽然有人对周暄说：“我们朝敏原来在单位里特别受欢迎，瞧她现在比以前还要年轻，周暄你可要好好珍惜啊，不然小心被别人拐跑啦！”

表2 两组细胞因子表达比较

三、HCV-RNA载量与细胞因子的相关分析

表3 HCV-RNA载量与细胞因子的偏相关分析

四、丙肝组中细胞因子间相关分析

在控制年龄、性别、甘油三酯及总胆固醇等因素后,TNF-α与IL-1β、IL-12β、IL-10、IL-4及TGF-β间偏相关分析:TNF-α与IL-1β呈正相关(r=0.530,P=0.008),与IL-12β呈正相关(r=0.760,P=0.000),与IL-10呈负相关(r=-0.730,P=0.000),与TGF-β呈负相关(r=-0.740,P=0.000),IL-1β与IL-12β呈正相关(r=0.450,P=0.030),IL-10与TGF-β呈正相关(r=-0.999,P=0.000)。见表4。

2.2 东、西坡不同坡位捕食线虫真菌的多样性差异将高黎贡山研究区域分为5个坡位，分别为下坡位（1 400～1 800 m）、中下坡位（1 800～2 200 m）、中坡位（2 200～2 600 m）、中上坡位（2 600～3 000 m）、上坡位（3 000～3 400 m）。对高黎贡山东、西两坡相同坡位的捕食线虫真菌物种丰富度和检出率进行比较。结果表明东、西坡捕食线虫真菌的物种丰富度和检出率随着坡位的升高均呈先上升后下降的趋势，其中东坡各指数均在中下坡位处呈现最大值，西坡物种丰富度在中下坡位处呈现最大值，检出率在中坡位处呈现最大值。见图2～3。

表4 丙肝组中细胞因子间相关分析

讨 论

本组实验检测了HCV感染的肝硬化患者单核细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-12β及抗炎因子IL-10、IL-4、TGF-β mRNA的转录水平,结果显示抗炎因子IL-10和TGF-β表达明显升高。

1.外周血单核细胞分离、培养及DNA的提取:人外周血单核细胞提取采用天津灏洋公司提供的人外周血单核细胞分离液试剂盒,产品编号:TBD2011H.Size:2×200 mL/kit。无菌,无支原体,内毒素<0.05 EU。空腹抽取受试者血液5 mL,试验方法严格按说明书,以0.5 mL单核细胞完全培养基(产品编号:HCTBD2011)重悬细胞,差异贴壁法纯化、收集细胞,加入0.5 mL的RNA保护液,存-80℃备用。

在本实验中肝硬化患者单核细胞还高表达TGF-β,TGF-β通过两个方面影响疾病的进展。首先TGF-β是最重要的肝星状细胞的激活因子[12],诱导纤维化基因的转录及上调胶原蛋白的表达[13-14],促进肝纤维化和肝硬化的形成。另外，TGF-β还可通过影响免疫细胞的分化、发育、稳态和诱导免疫耐受来调节免疫反应。TGF-β能够促进Treg 细胞发育和诱导介导多种慢性炎症反应的Th17细胞的产生[15]。

单核细胞IL-10和TGF-β的高表达,抑制了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-12β的表达,导致了单核细胞清除HCV的能力,同时激活HSC,促进了肝纤维化的持续进展[16]。

本实验的相关分析中,单核细胞TNF-α、IL-12β与HCV-RNA的载量正相关,IL-10和TGF-β与HCV-RNA的载量呈负相关,该结果与多数文献报道相符。在病例组中, HCV-RNA高载的患者未高水平表达TNF-α、IL-12β,可能高载的HCV-RNA未刺激单核细胞高表达促炎因子而高表达抗炎细胞因子,进一步说明，持续HCV感染可能导致单核细胞免疫功能的损害,导致持续的HCV感染。也可能体内的抗炎机制为防止过度的炎性反应损害机体,高表达并分泌抗炎因子如IL-10、TGF-β,减少组织的损伤并促进组织的修复。也有文献报道HCV-RNA的高复制促进了IL-10的产生,其机制尚不明确,可能由于HCV特异性的效应T细胞被抑制的结果[10]。也可能与患者处于肝硬化期,各种影响因素如ALT、血脂等较多有关,其次可能纳入的样本量偏少,还需要更大的样本量进一步证实。

此次实验中患者HCV-RNA的载量与单核细胞的促炎因子呈正相关,与抑炎因子的表达呈负相关。而仅有抑炎因子的高表达差异有统计学意义。可能由于肝硬化阶段单核细胞清除HCV的能力下降,其处于持续修复受损的肝细胞,因此高表达IL-10和TGF-β。

另外此次实验中IL-4在两组受试者中没有差异,其与HCV-RNA载量并未表现出相关性,与促炎及抑因子也不相关。IL-4在本实验中的“沉默”表现,可能与的其多效性、复杂性、双向性[17-24]的生物学特性有关,单核细胞IL-4的表达是否与丙肝肝硬化的发生发展目前相关研究较少。

丙型肝炎肝硬化患者单核细胞IL-10和TGF-β的高表达,与HCV-RNA呈负相关,同时与细胞因子IL-10和TGF-β呈现高度正相关,IL-10和TGF-β可能与丙型肝炎肝硬化发生发展密切相关,也可能丙肝肝硬化患者单核细胞的免疫耐受是肝硬化进展的主要动力。对其机制的进一步探索可能为肝硬化的逆转提供线索。