维生素B6和丰诺安对X射线辐照小鼠外周血细胞的保护作用及意义

司少艳 朱晓瓞 宋淑军 吴莹莹 秦亚亚 岳茂兴

核能与核技术在给人类带来益处的同时,核辐射也对人类健康构成极大的威胁。核辐射产生的电离辐射可通过氧化应激机制,造成人和动物多个系统器官损伤和功能障碍,其中造血系统和免疫系统是最为敏感的系统。造血系统辐射损伤的主要远期效应之一就是造血衰老、骨髓抑制。而免疫系统是抵御病原微生物入侵以及抗肿瘤的第一道防线,对于维持机体内环境稳定和人体的健康非常重要。免疫系统的损伤则导致机体对微生物的易感性增加,以及患肿瘤的风险增加。因此,寻找辐射损伤后恢复造血功能和免疫功能的有效方法,对辐射损伤救治有重要意义。研究显示:维生素B6和多种氨基酸具有抗氧化和免疫调节作用[1-9]。本研究中，笔者观察了维生素B6和丰诺安(20AA复方氨基酸)对电离辐射引起的造血和免疫损伤的保护作用。

材料和方法

一、材料

不同荧光素标记的抗小鼠抗体包括PerCP-CD3、FITC-CD4、PE-NK1.1、APC-CD19、PE-CD25、APC-FoxP3抗体,Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation/Permeabilization Diluent、10×Permeabilization Buffer均为美国eBioscience公司产品;10×红细胞裂解液为美国Biolengend公司产品;维生素B6氯化钠注射液为石家庄四药有限公司生产,维生素B6含量为每250 mL含2.5 g;丰诺安(20AA复方氨基酸注射液)为辰欣药业股份有限公司生产;健康6～8周龄雌性ICR小鼠,购自北京大学医学部实验动物医学研究中心。

二、小鼠X线照射模型及给药处理

(一)X线照射小鼠模型

将小鼠装入特制的有机玻璃盒中,采用AXESSE医用直线加速器进行一次性X线照射,主要技术参数:采用6MVX线,源轴距(source axis distance,SAD)为101.5 cm,剂量率600 cGy/min,照射剂量为3 Gy,照射野为30 cm×30 cm。

(二)小鼠分组及给药方案

将 ICR小鼠按随机数字表法随机分为对照组、模型组、维生素B6组、丰诺安组和联合组,每组7只。除对照组外,其余4组小鼠均接受X线照射。从照射前4 d开始至照射后的第10天,1次/d腹腔注射给药：维生素B6组小鼠注射0.3 mL用等渗盐水1∶2稀释的维生素B6氯化钠注射液,丰诺安组小鼠注射0.3 mL用等渗盐水1∶2稀释的丰诺安(20AA复方氨基酸注射液),联合组小鼠注射0.15 mL维生素B6氯化钠注射液+0.15 mL丰诺安(20AA复方氨基酸注射液)的混合液,对照组和模型组小鼠腹腔注射0.3 mL等渗盐水。照射后的第11天,小鼠称量体重,摘眼球取血,乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)抗凝,用于以下指标的检测。

三、观察指标

(一)自细胞分类计数

采用全自动血球计数仪对小鼠外周血自细胞进行分类计数。

(二)淋巴细胞亚群分析

取100 μl EDTA抗凝血,分别加入PerCP-CD3、FITC-CD4、APC-CD19和PE-NK1.1抗体用于检测总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和自然杀伤(natural killer cell,NK)细胞,分别室温避光培养30 min后,加2 mL红细胞裂解液溶解红细胞;磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗2遍后,加入20 g/L多聚甲醛溶液0.3 mL;流式细胞仪分析总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞在淋巴细胞中的百分比,然后根据血常规淋巴细胞浓度,计算相应淋巴细胞亚群在外周血中的浓度。

取100 μl EDTA抗凝血,加入FITC-CD4、PE-CD25抗体,室温避光30 min;加入1 mL破膜液,4℃避光30 min;用1×缓冲液洗涤2次后,加入APC-FoxP3,4℃避光30 min;用1×缓冲液洗涤2次后,加300 μl PBS;流式细胞仪分析Treg细胞在淋巴细胞中的百分比,然后根据血常规淋巴细胞浓度,计算Treg细胞亚群在外周血中的浓度。

四、统计学分析

结 果

一、维生素B6和(或)丰诺安对X线照射小鼠血常规的影响

与对照组相比,模型组小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血小板数量和血红蛋白浓度均显著降低(P<0.05)。与模型组相比,维生素B6组、丰诺安组和联合组小鼠白细胞总数和血小板数量显著升高(P<0.05),血红蛋白浓度虽有所回升,但仍均低于对照组(P<0.05);维生素B6组和联合组小鼠淋巴细胞数量显著升高(P<0.05),维生素B6组小鼠淋巴细胞数量仍显著低于对照组(P<0.05),而联合组小鼠淋巴细胞数量与对照组无显著差异(P>0.05)。与联合组相比,维生素B6组小鼠中性粒细胞百分比和单核细胞数量高于联合组,淋巴细胞百分比高于联合组(P<0.05);丰诺安组小鼠白细胞总数、中性粒细胞和淋巴细胞数量低于联合组(P<0.05)。见表1。

表1 维生素B6和(或)丰诺安对X线照射小鼠血常规的影响

二、维生素B6和(或)丰诺安对X线照射小鼠淋巴细胞亚群的影响

与对照组相比,模型组小鼠外周血NK细胞、总T细胞、CD4+和CD8+T细胞数量均显著降低(P<0.05),B细胞和Treg细胞数量无明显变化(P>0.05);与模型组相比,维生素B6组、丰诺安组和联合组小鼠上述指标均显著回升(P<0.05),但总T细胞、CD4+和CD8+T细胞数量仍显著低于对照组(P<0.05);同时维生素B6组和联合组小鼠外周血B细胞数量显著高于对照组和模型组(P<0.05);与联合组相比,丰诺安组小鼠NK细胞数量和总T细胞和CD4+T细胞数量均低于联合组(P<0.05)。与对照组相比,模型组、维生素B6组、丰诺安组和联合组小鼠外周血总T细胞、CD4+和CD8+T细胞百分比均显著降低(P<0.05),B细胞、Treg细胞百分比和CD4/CD8比值均显著升高(P<0.05),丰诺安组和联合组小鼠NK细胞百分比显著升高;与模型组相比,联合组小鼠NK细胞百分比显著升高(P<0.05),B细胞和Treg细胞百分比显著降低(P<0.05)。见表2、图1～3。

表2 维生素B6和(或)丰诺安对X线照射小鼠淋巴细胞亚群百分比和CD4/CD8比值的影响

图1 淋巴细胞亚群占淋巴细胞百分比流式分析图

图2 Treg细胞占淋巴细胞百分比流式分析图

图3 维生素B6和(或)丰诺安对X线照射小鼠淋巴细胞亚群数量的影响

讨 论

丰诺安是由20AA复方氨基酸注射液组合而成的氨基酸溶液。氨基酸除了提供营养、参与蛋白合成,转化为糖或脂肪进入三羧酸循环进而发挥供能作用外,近年来的研究显示,某些氨基酸具有抗氧化和免疫调节作用。研究证明,精氨酸(arginine,Arg)可促进淋巴细胞增殖及细胞因子生成,基础饲粮中添加Arg可诱导白细胞及细胞因子的产生来增强仔猪的细胞免疫和体液免疫功能[1-2]。甘氨酸(glycine,Gly)为自然界中结构最简单的氨基酸,除了参与蛋白质及代谢性生理分子的合成,还具有抗氧化应激及免疫调节作用[3]。谷氨酸胺(glutamine,Gln)是人和动物体内含量最丰富的游离氨基酸,可增加巨噬细胞和淋巴细胞的分化,促进免疫细胞因子的产生[4],有效提高黏膜中免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)的产生及T淋巴细胞、辅助性T细胞(helper cells,Th)及细胞毒性T细胞(cyto-toxic T cells,Tc)的数量[5],对调节肠道免疫功能有重要作用。而含硫氨基酸的抗氧化保护作用可以通过其自身的抗氧化作用,以及合成具有重要抗氧化作用的物质(谷胱甘肽)2种途径实现[6]。研究显示[15]:连续给予大鼠氨基酸复合剂60 d,具有降低血清、肝组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的作用;同时具有升高血清、肝组织中只超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力的作用,表明氨基酸复合剂具有抗氧化作用。陈勇等[16]研究发现:胃癌患者根治术预防性应用复方氨基酸注射液,能够减缓蛋白消耗、改善营养状况,提高机体免疫功能,降低患者的术后感染。岳茂兴等[17-18]对维生素B6联用丰诺安新疗法的研究表明:丰诺安所含有的氨基酸谱与人体血液成分相近,可以安全高效地为人体提供种类最丰富、最全面,同时具有强劲动能的游离氨基酸,易被人体所利用,具有改善肝功能、迅速保护支持重要器官的功能。

维生素B6是在代谢和功能上相关的一类吡哆醇的总称,包括吡哆醛(PL),吡哆醇(PN)和吡哆胺(PM),是动物体内重要的营养素,也是机体中的100多种与转氨、脱硫及脱羧反应有关的酶以及人体内约140种酶的辅酶,参与催化80多种生化反应在人体蛋白质代谢、糖原分解为葡萄糖及脂类代谢中具有不可替代的作用。它在促进机体生命新陈代谢中起到十分重要的作用[19-20]。研究显示[7]：在核酸和蛋白质代谢中维生素B6参与了抗氧化反应和DNA 和信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)的合成,在免疫应答过程中维生素B6参与了细胞免疫、体液免疫,其缺乏会导致淋巴器官的萎缩,细胞免疫功能降低,淋巴细胞生成的减少,白细胞介素-2的生成和抗体反应发生改变[8-9]。岳茂兴等[21-24]的长期临床与基础研究证实:丰诺安与维生素B6合用具有促进机体止血、利尿、解毒、保护大脑及神经系统功能、改善肝功能、减轻肺损伤、提高机体免疫功能、凝血功能和营养状况的功效。能为急危疑难重症患者赢得关键性的综合治疗时间,从而逆转疑难危重病患者的病情。并且维生素B6在人体内的半衰期比较短,能被较快地排出体外。因此用药安全,一般不会对患者产生严重毒副作用。自2008年广泛应用以来,已在全国多家医院推广应用,未发生一例过量事件。且长期使用安全、疗效确切、副作用小,能满足急危疑难危重症患者治疗需要。

由于氨基酸和维生素B6具有抗氧化和免疫调节作用,因此笔者初步观察了丰诺安和维生素B6是否能够改善电离辐射对造血和免疫系统的损伤。结果显示:丰诺安、维生素B6、维生素B6与丰诺安的复合液均可以提高X线照射小鼠的白细胞总数、淋巴细胞、NK细胞、B细胞、总T细胞、CD4+和CD8+T细胞、血小板的数量;联合组(维生素B6联用丰诺安)在提高总T细胞数量和CD4+T细胞数量效果上优于维生素B6,在提高白细胞总数和淋巴细胞数量效果上优于丰诺安组,提示丰诺安和维生素B6联合应用效果优于单一应用。丰诺安和维生素B6对外周血细胞的保护作用的具体机制可能与氨基酸和维生素B6的抗氧化,以及免疫调节作用有关,有待进一步深入研究。