离子色谱法测定岩藻聚糖中L-岩藻糖

陈伟珠，方华，张怡评，晋文慧，陈晓莹，洪专

（自然资源部第三海洋研究所，自然资源部海洋生物资源综合利用工程技术研究中心，福建省海洋生物资源开发利用协同创新中心，福建厦门 361005）

岩藻聚糖即岩藻聚糖硫酸酯，是Kylin 于1913年首次从掌状海带中提取的，是一类含有L-岩藻糖和硫酸基团，并伴有其它单糖（如半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖）的水溶性杂多糖。L-岩藻糖和硫酸根是其主要组成成分，另外，还含有甘露糖、半乳糖、蛋白质、木糖、糖醛酸等单糖组成成分。岩藻聚糖具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、免疫调节等活性，是一种重要的生物活性物质［1–3］。构效关系研究结果表明，L-岩藻糖是影响岩藻聚糖生物活性的重要组成成分，是岩藻聚糖硫酸酯的重要指标性成分。而且L-岩藻糖作为岩藻聚糖的特征单糖，常用于衡量岩藻聚糖的纯度。因此，在岩藻聚糖的开发利用中，需要有准确、可靠的L-岩藻糖含量测定方法用于岩藻聚糖的质量控制。

L-岩藻糖属于单糖，没有紫外可见光吸收，一般采用气相色谱法［4］、高效液相色谱法［5–7］测定。气相色谱法需要将岩藻糖衍生化才能检测，步骤繁琐。高效液相色谱法主要分为两种：直接测定法和柱前衍生法。无需衍生的高效液相色谱法是采用蒸发光散射检测器(ELSD)［5–6］或示差折光检测器(RID)［7］。示差折光检测器对环境温度的稳定性要求较高，不适合采用梯度洗脱分析，且灵敏度低。ELSD 灵敏度稍高于RID，但灵敏度仍不理想，且基线噪音大。柱前衍生的高效液相色谱法是利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、对氨基苯甲酸(p-AMBA)等衍生剂，通过反应使L-岩藻糖分子上增加紫外吸收基团，采用紫外检测器检测［8–12］。但柱前衍生法步骤繁琐，空白干扰多。

脉冲离子色谱法是近年发展起来分析糖类物质的方法之一［13–15］。使用该方法，样品不需要衍生便可直接分离测定单糖，且灵敏度极高。笔者建立了离子色谱法测定L-岩藻糖的含量，该方法简单快速，灵敏度高，适合用于L-岩藻糖的定性、定量检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

离子色谱仪：ICS–4000 型，附带脉冲安培检测器和AgCl 参比电极，美国戴安公司；

L-岩藻糖标准样品：上海美伦生物有限公司；

L-岩藻糖标准储备液：20 mg／mL，精密称取100 mgL-岩藻糖样品，用水溶解并定容于5 mL 容量瓶中；

NaOH 溶液：250 mmol／L，美国赛默飞世尔公司；岩藻多糖样品：实验室自制（于海带中提取）；实验室用水为蒸馏水。

1.2 L-岩藻糖系列标准工作溶液的配制

精密移取不同体积的L-岩藻糖标准储备液，用蒸馏水稀释并定容，配制成质量浓度分别为0.11，0.56，2.24，5.60，11.20，22.40，44.80 μg／mL 的L-岩藻糖系列标准工作溶液。

1.3 岩藻多糖样品溶液的制备

参考文献［16］，准确称取岩藻聚糖样品10 mg 于10 mL 试管中，加入0.60 mL 浓盐酸，置于100℃中水解3 h，冷却至室温后过滤，再用蒸馏水洗涤滤渣，合并滤液及洗液，用水定容至10 mL。

1.4 色谱条件

保护柱：CarboPac PA10 柱(50 mm ×4 mm)，美国戴安公司；分析柱：CarboPac PA10 柱(250 mm×4 mm)，美国戴安公司；流动相：H2O–250 mmol／L NaOH 溶 液（90∶10），流 量 为1.00 mL／min； 柱温：30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱

采用离子色谱法检测糖类化合物常用糖类分离色谱柱。分别选择CarboPac PA10 柱（250 mm ×4.0 mm）和CarboPac PA1 柱（250 mm×4.0 mm）作为色谱柱，在流量1.00 mL／min、柱温30℃和淋洗液H2O–250 mmol／L NaOH 溶液（93∶10）条件下，对岩藻聚糖水解后各个组分的分离效果进行考察。试验结果表明，当分别使用CarboPac PA10 柱和PA1 柱时，岩藻多糖水解后的组分均可实现基线分离（如图1 所示），而采用PA10 柱时样品运行时间较短，故选择PA10 柱。

图1 岩藻聚糖水解后的离子色谱图

2.1.2 淋洗液

在淋洗液流量为0.80 mL／min 和柱温为30℃条件下，分别选择H2O 与250 mmol／L NaOH 溶液的体积比为90∶10，95∶5，93∶7 进行试验，考察淋洗液组成对岩藻聚糖水解产物的分离效果。结果表明3 种配比的淋洗液对水解后岩藻聚糖样品均可实现基线分离，而使用淋洗液H2O–250 mmol／L NaOH 溶液（90∶10）时样品运行时间较短，因此选择该配比的淋洗液。

2.1.3 淋洗液流量

确定淋洗液后，分别设定流量为0.60，0.80，1.00 mL／min 进行试验，考察水解后岩藻聚糖样品的分离效果。结果表明，淋洗液流量对样品的分离效果基本无影响。当淋洗液流量为1.00 mL／min 时运行时间较短，因此选择淋洗液流量为1.00 mL／min。

2.1.4 柱温

分别选择色谱柱柱温为30，35，40℃进行试验，结果表明随着柱温的提高，运行时间稍微缩短，但分离效果基本无差别。综合考虑色谱柱的使用效率，最终选择柱温为30℃。

2.2 线性关系

按照1.3 色谱条件，分别测定L-岩藻糖系列标准工作溶液，每个浓度测定1 次，记录L-岩藻糖色谱峰面积，以L-岩藻糖系列标准工作溶液的质量浓度X（μg／mL）为自变量、色谱峰面积Y为因变量进行线性回归，得线性方程：Y=1.324 2X+1.656 2，相关系数（r2）为0.992 4，表明L-岩藻糖的质量浓度在0.11～44.80 μg／mL 范围与色谱峰面积线性关系良好。

2.3 检出限和定量限

将低浓度L-岩藻糖标准工作溶液逐级稀释后测定，以信噪比（S／N）为3 对应的质量浓度为检出限，信噪比为10 对应的质量浓度为定量下限，得本法检出限为0.05 µg／mL，定量限为0.10 µg／mL。

2.4 加标回收试验

精密称取岩藻聚糖（L-岩藻糖含量为0.20%）10.00 mg，共6 份，分别加入精密称定的L-岩藻糖1.00 mg，按照1.2 项进行处理，制备样品溶液，按照1.3 色谱条件进行样品测定，加标样品色谱图如图2所示。利用试验数据计算平均加标回收率和相对标准偏差，试验数据列于表1。由表1 可知，样品加标平均回收率为91.79%，相对标准偏差为2.77%，表明该方法的精密度、准确度良好。

图2 加标样品色谱图

表1 加标回收试验结果

3 结语

建立了岩藻聚糖中L-岩藻糖的离子色谱分析方法，该方法运行时间短，灵敏度高，无需衍生，是测定岩藻聚糖中L-岩藻糖含量的有效方法。