生防菌使用方式对烟草青枯病的防效及根际土壤细菌群落的影响

黎妍妍，李春黎，王林，彭五星，杨勇，陈守文，李锡宏

1 湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；

2 湖北大学 生命科学学院，武汉 430070；

3 湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040；

4 恩施州烟草公司 宣恩县烟叶分公司，恩施 445500

烟草青枯病由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的细菌性土传病害，每年给烟叶生产造成巨大损失[1]。经过近年来绿色防控重大专项的实施，烟草青枯病的防治主要以生物防治为主。生物防治不仅对植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生产中存在的农药残留和病菌抗药性等问题[2-3]。利用生防菌是植物病害生物防治的重要手段。目前，生防菌多采用菌液兑水灌根的方式施用[4-5]。然而，由于土壤微生态环境的复杂性[6]，生防菌进入土壤后，土壤微生物对这种外来“入侵者”会产生强烈的排斥作用。由于环境不适、营养不足等原因，施用的生防菌往往无法定殖，从而不能很好地发挥其生防功能，致使其抑菌功能和控病作用难以显现。因此，根据土壤微生态原理的营养抗性理论，应在生防菌的使用等方面加以改进[7]。本研究旨在通过田间小区试验和扩增子测序技术，探究生防菌剂不同使用方式对烟草青枯病的防控效果及其对烟株根际土壤细菌群落的影响，以期为进一步提升生防菌的防控效果提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生防菌株（YH-22）[5]为芽孢杆菌，按相关工艺将其发醇、干燥成粉剂（1.0×1010CFU/g）；米糠为市场购入。

1.2 试验地点及试验设置

2018年在湖北省恩施州宣恩县（29.97°N，109.38°E）开展该试验。试验地连作15年，青枯病发生严重。试验设置5个处理，GG为生防菌兑水灌根，生防菌：水按1∶500混匀后灌根50 mL/株；WG为生防菌拌土围根，生防菌：土按1: 1000混匀后围根100 g/株；MK+WG为米糠+生防菌拌土围根，米糠: 生防菌: 土为60∶1∶940，先将米糠和生防菌混合均匀，喷水后覆膜、发醇20～25 d，然后拌土围根100 g/株；CK1为清水灌根50 mL/株；CK2（MK）为米糠拌土围根，米糠：土按3∶47混匀后围根100 g/株。随机区组排列，3次重复，每小区种植烤烟60株，株行距为0.55 m×1.2 m，烟草品种为云烟87。烟叶移栽时和移栽后40 d各处理各施用一次，每次剂量相同。

1.3 烟草青枯病发生情况调查

1.4 烟株根际土壤样品采集

烟叶移栽后100 d 时，选取每小区长势较为一致的5 株烟株，采集根际土壤（与根系结合较紧密的4 mm 内的土壤）样品。每小区5 株烟株根际土样混合形成一个样品，共采集15个土样。将土样置于干冰（固态CO2）中带回实验室，放置于-80℃冰箱中保存，以备提取DNA。

1.5 土壤微生物群落分析

1.5.1 DNA 提取及PCR 扩增

采 用FastDNA Spin Kit 试 剂 盒（MP Biomedicals, USA） 提 取 土 壤 总DNA。 以515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）为引物对细菌16S rDNA V4 可变区进行PCR 扩增。30 μL 扩增体系包括：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL 引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL ddH2O。反应程序包括：98℃ 1 min；98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s（30 个循环）；72℃ 5 min（Bio-rad T100 梯度PCR 仪）。PCR 产物检测合格后进行文库构建，使用Illumina Hiseq PE250测序平台进行测序（由诺禾致源生物信息科技有限公司完成）。

1.5.2 OTU 聚类与物种注释

以97%的一致性将所有样品的有效序列聚类为OTUs。对OTUs 代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析。

1.6 数据处理

利用R软件（V 2.15.3）绘制稀释曲线图。利用Qiime 软件（V 1.9.1）计算Sobs、Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数。在门分类水平上，基于加权Unifrac距离，利用Qiime软件（V 1.7.0）对土壤细菌群落组成进行UPGMA聚类分析。用SPSS 22.0中的One-way ANOVA分析烟草青枯病病情指数和细菌群落组成等在各处理间的差异（P＜0.05水平）。根据属水平上的物种注释和丰度信息，对各样品的物种丰度进行标准化处理，得到Z值，采用HemI软件（V1.0）绘制Heatmap图。Z=（a-Av）/SD，其中a为样品在该分类上的相对丰度，Av为所有样品在该分类的平均相对丰度，SD为所有样品在该分类上的标准差。

2 结果与分析

2.1 烟草青枯病发生情况

烟叶移栽后100 d 对烟草青枯病发生情况进行了调查与分析。结果表明，GG、WG 和MK+WG处理烟草青枯病病情指数均显著低于CK1，WG 和MK+WG 处理烟草青枯病病情指数均显著低于CK2。依据病情指数，计算得GG、WG、MK+WG 和CK2相对于CK1 的防效分别为49.72%、55.93%、59.32%和36.72%，表明生防菌不同施用方式对烟草青枯病的防效表现为MK+WG＞WG＞GG（图1）。

图1 烟草青枯病发生情况Fig. 1 The occurrence of tobacco bacterial wilt

2.2 根际土壤测序深度评估

以细菌有效序列数为横坐标、OTU 数量为纵坐标的土壤细菌群落稀释曲线表明，在97%一致性的OTUs 分类水平下，测序量增加的初始阶段时OTU数量急剧上升；之后，OTU 数量基本趋向于平缓，表明测序数量基本合理，可反映土壤细菌群落绝大多数序列信息（图2）。

图2 根际土壤细菌群落OTUs 稀释曲线Fig. 2 Rarefaction curve of bacterial community in rhizosphere soil OTUs

2.3 土壤细菌群落多样性和丰富度分析

对根际土壤细菌群落多样性和丰富度进行了差异分析。土壤细菌群落OTU数量以WG、MK+WG和CK2显著高于CK1，而与GG间无显著差异；Sobs和Shannon指数在GG、WG、MK+WG和CK2间无显著差异，但均显著高于CK1；Chao1指数以WG、MK+WG显著高于CK1，而与GG、CK2无显著差异。其中，OTU数量、Sobs和Shannon指数均以MK+WG处理最高，分别较其它处理高2.72%～54.04%、2.62%～49.01%和1.23%～21.40%；C h a o 1 指数以W G 处理最高，较其它处理高0.53%～40.35%（表1）。

表1 土壤细菌群落多样性和丰富度分析Tab. 1 The analysis of diversity and richness of soil bacterial community in rhizosphere soil

2.4 门水平上土壤细菌群落组成分析

2.4.1 土壤主要细菌门相对丰度分析

对相对丰度排名前1 0 位的土壤细菌门进行了分析。在各处理根际土壤中，变形菌门（Proteobacteria）相对丰度最高，占40.26%～50.68%；其它细菌门分别为放线菌门（Actinobacteria，7.70%～21.64%）、酸杆菌门（Acidobacteria，9.69%～16.76%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，4.8 7%～9.6 6%）、厚壁菌门（F i r m i c u t e s，1.87%～13.62%）、绿弯菌门（Chloroflexi，3.57%～6.74%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，3.04%～5.90%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，0.41%～2.60%）、 疣微菌门（Verrucomicrobia，1.11%～2.07%）和浮霉菌门（Planctomycetes，1.15%～2.00%）。这10个细菌门的相对丰度共占94.64～97.03%（表2）。

表2 土壤细菌群落主要门的相对丰度Tab. 2 The relative abundance of soil bacterial community at major phylum levels

根际土壤中放线菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门和绿弯菌门的相对丰度在各处理间存在显著差异。GG中芽单胞菌门的相对丰度显著高于CK1，增加67.56%；酸杆菌门的相对丰度显著高于其它处理。WG中放线菌门的相对丰度显著高于CK1和CK2，分别增加130.78%和99.66%；芽单胞菌门的相对丰度显著高于CK1，增加98.36%。MK+WG中放线菌门和绿弯菌门的相对丰度均显著高于CK1和CK2，其中放线菌门分别增加181.04%和143.15%，绿弯菌门分别增加68.50%和88.80%。GG、WG和MK+WG处理中厚壁菌门的相对丰度均显著低于CK1，而与CK2无显著差异。

2.4.2 门水平上土壤细菌群落聚类分析

对各处理根际土壤细菌群落在门分类水平上进行了UPGMA聚类分析。各处理间土壤细菌群落门水平的组成及丰度差异较为明显。WG和MK+WG处理相似性较高，聚为一类；GG和CK2相似性较高，聚为一类；CK1单独为一类。以上结果表明WG和MK+WG处理对烟株根际土壤细菌群落组成具有较大影响（图3）。

图3 土壤细菌在门分类水平上的UPGMA 聚类树图Fig. 3 UPGMA clustering tree diagram of soil bacteria at phyla level

2.5 属水平上土壤细菌群落组成分析

对各处理根际土壤中主要细菌属的相对丰度进行了分析。GG、WG、MK+WG和CK1、CK2中相对丰度＞1%的细菌属分别有7、7、7和11、5个（表3）。对各处理土壤样本中这19个细菌属的相对丰度相似性绘制了Heatmap图（图4），结果表明，WG和MK+WG处理相似性较高，聚为一类；CK1和CK2相似性较高，聚为一类；GG单独为一类。

图4 属水平上土壤细菌丰度聚类热图Fig. 4 Heatmap of relative abundance of soil bacteria at genus level

表3 土壤细菌群落主要属的相对丰度Tab. 3 The relative abundance of soil bacteria community at major genus levels

对这些细菌属的相对丰度在各处理间的差异进行了方差分析， 结果显示，Mizugakiibacter、Sphingomonas、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Roseburia、Massilia、Rhodanobacter、Bryobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相对丰度在各处理间存在显著差异。

与CK1相比，GG处理显著提高了土壤中Massilia和Gaiella的相对丰度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Roseburia和Rhodanobacter的相对丰度；WG和MK+WG处理显著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相对丰度，降低了Mizugakiibacter、Proteus、Burkholderia-Paraburkholderia、Roseburia和Bryobacter的相对丰度；此外，WG处理还显著降低了Rhodanobacter的相对丰度。与CK2相比，GG处理显著降低了Sphingomonas的相对丰度；W G 和M K+W G 均显著提高了Pseudarthrobacter、Ramlibacter和Gaiella的相对丰度，而降低了Sphingomonas和Burkholderia-Paraburkholderia的相对丰度；此外，WG处理还显著提高了Gemmatimonas的相对丰度，MK+WG处理还显著提高了Bradyrhizobium的相对丰度。

3 讨论

生防菌在防治作物青枯病中的研究与应用已有较多报道。研究表明，生防菌的防效通常受生防菌、病原菌、植株和环境等多方面的影响[8]。这些方面相互作用，造成根际土壤微生物群落结构的改变，进而影响烟草青枯病的发生与流行。因此，分析生防菌的使用对土壤微生物群落的影响，对于探明生防菌防控青枯病的机理，改进并探寻合适的使用方式具有重要意义。

本研究在进行烟草青枯病发病情况调查时发现，无论是与CK1（清水灌根）相比较，还是与CK2（米糠围根）相比较，生防菌拌土围根、米糠+生防菌拌土围根的使用方式均能显著降低烟草青枯病的病情指数，而这两者之间并无显著差异，表明对烟草青枯病起主要防控作用的是生防菌。有研究指出可以通过改进生防菌的使用方法来提升生防菌的拮抗效果[7]，添加一些载体材料可以提高生防菌的定殖能力和有效性[11-12]。本研究中添加的米糠和生防菌发醇可能有助于促进两者融合，使米糠为生防菌提供空间保护，更有利于生防菌在土壤环境中定殖；同时，米糠中富含的丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素和矿物质等，可作为营养介质为生防菌提供持续的营养，从而使生防菌在营养上处于优势。

一般来说，微生物群落多样性和丰富度指数越高，其响应各种胁迫的修复能力也越强[9]。与青枯病发病烟田相比，健康烟田烟株根际土壤具有较高的微生物群落多样性和丰富度[10]。本研究结果显示，生防菌拌土围根、米糠+生防菌拌土围根较生防菌兑水灌根更能明显提高烟株根际土壤细菌群落的Sobs、Shannon和Chao1等多样性和丰富度指数，其中尤以米糠+生防菌拌土围根的提升效果显著，表明米糠+生防菌拌土围根更能提高烟株根际土壤细菌群落的修复能力，从而更好地保护烟株免受青枯菌的侵染。

从根际土壤细菌群落组成结果可以看出，具有拮抗作用或促生作用的细菌门的相对丰度在施用生防菌后发生了显著变化。生防菌兑水灌根和生防菌拌土围根显著提高了土壤中芽单孢菌门、生防菌拌土围根和米糠+生防菌拌土围根显著提高了土壤中放线菌门的相对丰度，这些细菌可能产生更多的抗生素或其它次生代谢产物来抑制土传病原菌的定殖，从而有利于植株健康生长[13-15]。

在属水平上，生防菌兑水灌根显著提高了土壤中Gaiella的相对丰度，生防菌拌土围根和米糠+生防菌拌土围根显著提高了土壤中Gemmatimonas、Pseudarthrobacter、Ramlibacter、Bradyrhizobium和Gaiella的相对丰度。研究表明，Gaiella属于放线菌门，其相对丰度的增加可显著抑制番茄枯萎病等土传病害[16]。与青枯病发病土壤相比，健康土壤中Gemmatimonas、Bradyrhizobium等细菌属的相对丰度显著提高[10]。由此可见，生防菌兑水灌根促使土壤中Gaiella等，生防菌拌土围根和米糠+生防菌拌土围根促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升，有利于恢复土壤健康。

需要指出的是，尽管在该研究中米糠+生防菌拌土围根和生防菌拌土围根在减轻烟草青枯病为害的作用中无显著差异，但前者在调理根际土壤细菌群落多样性以及结构中表现出一定的优势。因此，从长远角度讲，米糠+生防菌拌土围根可通过改善土壤微生态环境进一步减轻烟草青枯病的为害。

4 结论

本研究探究了生防菌不同使用方式（兑水灌根、拌土围根、米糠+生防菌拌土围根）对烟草青枯病的防效及调节土壤细菌群落的作用，为提升生防菌的防控效果提供了理论依据。生防菌不同使用方式对青枯病的防效表现为米糠+生防菌拌土围根（59.32%）＞生防菌拌土围根（55.93%）＞生防菌兑水灌根（49.72%）。生防菌拌土围根和米糠+生防菌拌土围根均可显著提高烟株根际土壤细菌群落的多样性和丰富度，以米糠+生防菌拌土围根效果最为显著。生防菌拌土围根和米糠+生防菌拌土围根对烟株根际土壤细菌群落结构具有显著影响，提高了土壤中放线菌门的相对丰度，促使土壤中Gaiella、Gemmatimonas、Bradyrhizobium等一些有益微生物比例上升。综合来看，米糠+生防菌拌土围根更有利于恢复土壤健康、减轻青枯病对烟株的为害。