大孔吸附树脂分离粉花绣线菊根中总黄酮工艺研究

缪艳燕，陈丽聪，徐剑

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

0 引言

粉花绣线菊（Spiraea japonica L. f.）为蔷薇科绣线菊属植物，主要分布于西南地区、华东地区以及内蒙古自治区。现代研究表明，绣线菊属植物含有生物碱、黄酮、萜类、酚类等多种化学成分，具有抗菌、抗病毒、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等多种生物活性，目前研究较多是二萜生物碱类成分[1]。前期研究中发现粉花绣线菊中含有含有生物碱、黄酮、挥发油、糖类等成分，而黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗炎镇痛等方面作用显著，对心血管系统疾病也有着显著疗效。本课题期望通过大孔吸附树脂分离纯化粉花绣线菊总黄酮，为后续粉花绣线菊总黄酮的药理活性研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器。UV-5900紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；JM-A10002电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；15×200 mm层析柱。

1.2 药材与试剂。粉花绣线菊植物（龙里县湾滩河镇湾寨乡采收，经我院严福林老师鉴定）；D101、AB-8、DM-130型大孔吸附树脂（蚌埠辽源新材料有限公司）；H-30、ADS-17型大孔吸附树脂（长沙承禹化工有限公司）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究所，批号100080-201409）。

2 方法与结果

2.1 大孔吸附树脂的预处理。将大孔吸附树脂置于烧杯中，95%乙醇浸泡过夜，湿法装柱后，用95%乙醇冲洗树脂柱，至流出液与三倍量蒸馏水混合无浑浊；再用蒸馏水过柱，直至流出液无醇味。用2BV 1% HCL 溶液通过树脂柱，浸泡2 h后用蒸馏水洗至流出液呈中性；最后用2BV 1% NaOH溶液过树脂柱，浸泡2 h后用蒸馏水洗至流出液呈中性[2]。

2.2 静态吸附。精密称取预处理的H-30，ADS-17，AB-8，D101，DM130树脂（用滤纸吸干）各3.000 g，分别置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入粉花绣线菊醇提液15.0 mL，吸附24 h，过滤，测定滤液中总黄酮含量，计算静态吸附量以及吸附率，结果见图1。

图1 五种大孔吸附树脂对总黄酮静态吸附结果

2.3 静态解吸。将上述五种静态吸附的大孔树脂分别置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液[10]50 mL，常温下解吸24 h，过滤，测定滤液中总黄酮的含量，计算静态解吸量和解吸率，结果如图2。

实验结果表明：以吸附率为指标，吸附效果由高到低依次为：AB-8＞ADS-17＞ H-30＞ D101＞DM130；以解吸率为指标，解吸效果由高到低依次为：AB-8＞D101＞ADS-17＞H-30＞DM130。综上可知，AB-8对总黄酮的吸附性和解吸性均最好，因此选择AB-8型大孔吸附树脂分离纯化粉花绣线菊根中总黄酮。

图2 五种大孔吸附树脂对总黄酮静态解吸结果

2.4 泄漏点的确定。精确量取预处理的AB-8型大孔吸附树脂20 mL（湿树脂），湿法装柱（1.5 cm×20 cm），将粉花绣线菊总黄酮液240 mL（浓度为0.5039 mg·mL-1）以0.5 mL·min-1的流速过树脂柱，每10 mL收集1份流出液，紫外分光光度法测定吸光度，计算总黄酮含量。当上柱药液达在60 mL时，流出液中总黄酮浓度达到上样液浓度的十分之一，总黄酮在树脂上的泄漏点为3 BV，为了节约和增效，故确定上样体积为2.5 BV。

2.5 洗脱剂浓度对解吸的影响。精密量取处理好的AB-8型大孔吸附树脂20 mL，湿法装柱（15×200）三份。取三份粉花绣线菊总黄酮液，各50 mL（浓度为0.5039 mg·mL-1），以0.5 mL·min-1的流速上样，收集流出液，用紫外分光光度法测定并计算流出液中总黄酮含量。上样后用5 mL蒸馏水通过树脂柱除杂，再分别用30%、50%、70%体积分数的乙醇各40 mL以0.5 mL·min-1的流速进行洗脱，收集洗脱液，用紫外分光光度法测定并计算洗脱液中总黄酮，结果如表1。

表1 不同浓度洗脱溶剂对解吸的影响

由表1可知，50%乙醇对粉花绣线菊总黄酮的解吸率较高，故选用50%乙醇进行洗脱。

2.6 洗脱剂用量的确定。精密量取处理好的AB-8型大孔吸附树脂20 mL，湿法装柱，按“2.5”项下方法上样，50%乙醇以0.5 mL·min-1的流速进行洗脱，每10 mL收集1次洗脱液，测定吸光度，计算总黄酮含量并绘制动态解吸曲线，结果如图3。

图3 洗脱剂用量考察

由图可知，当洗脱液用量到达70 mL（7 BV）时，曲线逐渐趋于平衡，说明粉花绣线菊总黄酮已接近充分洗脱。从节约溶剂角度，选择5BV为洗脱剂用量。

2.7 上样流速对解吸的影响。精密量取预处理的AB-8型大孔树脂20 mL，湿法装柱（15×200）三份。取三份上样溶液各50 mL（浓度0.9511 mg·mL-1），分别以0.5 mL·min-1，0.8 mL·min-1，1.0 mL·min-1的流速上样，收集流出液，测定吸光度，计算总黄酮含量及吸附率，结果如表2。

表2 上样流速的考察

由表2可知，当上样流速为0.5 mL·min-1时，AB-8型大孔吸附树脂对总黄酮的吸附率为77.53%，随着上样流速逐渐增大，树脂对总黄酮的吸附会逐渐降低。故选择上样流速为0.5 mL·min-1。

2.8 上样溶液pH对解吸的影响。精密量取预处理的AB-8型大孔树脂20 mL，湿法装柱（15×200）三份。用5%HCL或5%NaOH溶液调节总黄酮溶液（浓度0.6674 mg·mL-1）pH至4、6、8，上样50 mL后以0.5 mL·min-1的流速通过树脂柱，收集流出液，测定流出液中吸光度，计算总黄酮含量及吸附率，结果见表3。

表3 上样溶液pH的考察

由表3可知，总黄酮溶液pH值为4时，吸附率为87.37%，随着pH值的增大，吸附率逐渐降低；说明当上样溶液呈酸性时，大孔树脂对总黄酮的吸附效果较好，在偏碱性条件则吸附性能降低。

2.9 上样溶液浓度对吸附性能的影响。精密量取经预处理的AB-8型大孔树脂20 mL，湿法装柱（15×200）3份。1份取粉花绣线菊提取液（浓度为0.7740 mg·mL-1）40 mL，另2份分别稀释至50 mL（浓度为0.6192 mg·mL-1）和60 mL（浓度为0.5160 mg·mL-1），以0.5 mL·min-1的流速通过树脂柱，收集流出液，用紫外分光光度法测定流出液中总黄酮含量，计算吸附率，结果如表4。

表4 上样溶液浓度考察

由表4可知，上样浓度太大不利于总黄酮的吸附，上样溶液浓度为0.5160 mg·mL-1时，吸附率达到72.76%。

2.10 洗脱流速对解吸的影响。精密量取预处理的AB-8型大孔树脂20 mL，湿法装柱（15×200）3份。分别加入上样溶液50 mL（浓度为0.5456 mg·mL-1），均以0.5 mL·min-1的流速进行吸附，收集流出液，用紫外分光光度法测量流出液中总黄酮含量。接着用5 mL蒸馏水通过树脂柱，再加40 mL 50%乙醇分别以2.4 mL·min-1、0.8 mL·min-1、0.5 mL·min-1的流速进行洗脱，收集洗脱液，用紫外分光光度法测定总黄酮含量，并计算洗脱率，结果如表5。

表5 洗脱流速的考察

由表5可知，50%乙醇洗脱流速为0.5 mL·min-1时，解吸率可达到80.65%；但是随着洗脱流速增大到2.4 mL·min-1时，解吸率呈下降趋势，仅为65.31%。说明在进行解吸时，50%乙醇的流速不易太快。

3 讨论

3.1 大孔吸附树脂依靠自身与被吸附分子（吸附质）之间的分子间作用力和氢键作用发挥吸附性能，通过吸附性和分子筛原理，不同的有机化合物根据吸附力的差异和分离量大小，在被吸附后经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的[4]。影响大孔树脂分离纯化效果的因素其一是树脂及目标成分本身的性质，如极性，目标成分结构和分子量等；其二是实验中的变量，如上样和洗脱的浓度、流速，树脂用量，洗脱剂，径高比等[5]。实验中要对其中主要的因素进行考察优化。

3.2 本实验通过对五种大孔吸附树脂吸附-解吸性能的比较，选择AB-8型对粉花绣线菊根中总黄酮进行分离纯化，并通过不同指标的考察，最终确定最优条件为上样液浓度0.5160 mg·mL-1，上样体积2.5 BV，上样药液pH4，吸附流速0.5 mL·min-1，洗脱剂50%乙醇，洗脱剂用量5 BV，洗脱流速0.5 mL·min-1。