探索替莫唑胺联合amlexanox对胶质瘤细胞的作用效果及机制

熊金彪，郭高超，曹艺耀，陈旨娟，黄强，杨卫东

（天津医科大学总医院神经外科，天津300052）

多形性胶质母细胞瘤（GBM）占所有胶质瘤的60%~70%，是成人恶性程度和死亡率最高的原发性脑肿瘤[1]。过去几十年，胶质瘤治疗技术飞速发展，主要以脑肿瘤近全切，辅以放疗和（或）化疗为主，尽管如此，胶质瘤患者平均生存中位数仅约14.6个月，5年生存率仅为9.8%[2-3]。因此临床上迫切需要一种针对GBM更有效的治疗方案。

替莫唑胺（TMZ）是一种新型口服甲基化药物，具有多种抗肿瘤效果，被广泛用于治疗GBM[4]。尽管TMZ被视为治疗GBM最具前景的化疗药物，但由于耐药性，大部分患者接受TMZ治疗7个月后会出现GBM复发[5]。越来越多证据表明，蛋白激酶B（Akt）异常激活涉及多种类型肿瘤耐药性[6]。并且TMZ能诱导Akt激活，进而降低TMZ对肿瘤细胞的毒性作用[7]。此外，最近有研究表明，核因子κ-B激酶抑制剂（IKBKE、IKKε 或 IKKi）也能诱导激活 Akt[8]。

Amlexanox是一种选择性IKBKE抑制剂，被批准用于口疮溃疡和哮喘治疗[9-10]，对肥胖和2型糖尿病也有明确治疗效果[11-12]。而且，有研究证明amlexanox能有效抑制GBM细胞生长[13]。因此，笔者假设amlexanox能通过抑制IKBKE而逆转TMZ诱导的Akt激活，进而降低胶质瘤细胞耐药性，增强TMZ细胞毒作用，并通过一系列体内外实验对该假设进行验证。

1 材料与方法

1.1化学试剂抗IKBKE（#2690）、抗p-Akt（phospho-Ser473，#9271） 抗体购于美国 Cell Signaling Technology公司。抗 m-TOR（#36991）、抗 p-mTOR（phospho-Ser2448、#21214）抗体购于美国Signalway Antibody公司。抗Akt（#A18675）抗体购于美国AB－clonal公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、抗兔IgG（#ZB-2307、#ZB-2301）和 GAPDH（#TA505454）抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。Amlexanox（#S364805）购于Selleck.cn中国分公司，TMZ（#IT1330）购于中国索莱宝科技公司。Amlexanox和TMZ分别溶于二甲基亚砜试剂（DMSO、#D2650，Sigma，美国），储存于-20℃，储存浓度分别为500mmol/L（Amlexanox）和 100 mmol/L（TMZ）。

1.2 细胞培养

1.2.1 U87 MG细胞系 该细胞系购于美国ATCC中心，于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，孵育在37℃、5%CO2细胞培养箱。为防止细胞污染，培养基中混有100 U/mL青霉素/链霉素双抗。

1.2.2 原代GBM细胞 术后病理证实为星形胶质细胞瘤Ⅳ的新鲜肿瘤组织来源于天津医科大学总医院手术患者。被分离新鲜组织在离体1 h内经磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，去除血迹及正常脑组织，然后经胰酶于37℃环境中消化1 h。消化后的组织经离心后去掉上清液，剩余沉淀培养于含有10%FBS的F12培养基（Gibco，美国）中，并加入100 U/mL青霉素/链霉素预防污染，孵育于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱。

1.3 细胞增殖能力测定 细胞增殖能力由CCK-8实验测定。实验分为4组：对照组、amlexanox组、TMZ组、TMZ+amlexanox组，每组3个复孔。U87 MG和原代GBM细胞经离心、重悬、计数后接种至96孔板，每孔约 4×103细胞，于 37℃、5%CO2过夜贴壁。次日，更换含有设定浓度的单药（TMZ或amlexanox）或联合药物（TMZ和amlexanox）的培养基。继续于恒温细胞培养箱中孵育24、48、72 h后，分别于每孔中加入10 μL CCK-8试剂，轻柔晃动后，置于恒温细胞箱中培养2 h。培养结束后，用酶标仪检测每孔于450 nm处吸光度值，利用统计方法测定每组吸光度值的平均值以反映细胞增殖能力。实验重复3次。

1.4 迁移能力测定 利用划痕和Transwell迁移实验检测U87 MG和原代GBM细胞迁移能力。实验分组同CCK-8实验。细胞划痕实验过程如下：U87MG和原代GBM细胞经设定浓度单药或联合药物处理72 h后，离心、重悬，以每孔2×105细胞数接种至6孔板，于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱中过夜贴壁。至每孔单层细胞铺满底壁80%~90%时，用200 μL移液枪头于每孔底壁做出十字划痕，更换培养基以清除游离细胞。再于37℃、5%CO2恒温箱中培养0、12、24 h后，用相差倒置显微镜观察细胞迁移情况，每组取5个独立划痕视野拍照，计算划痕愈合面积进行统计学分析。Transwell迁移实验参照Liu等[13]研究。该实验独立重复3次。

1.5 侵袭能力测定 利用Transwell侵袭实验检测U87 MG和原代GBM细胞侵袭能力。实验分组同CCK-8实验。Transwell侵袭实验过程如下：处理后的 U87 MG 和原代 GBM 细胞（4×103）重悬于 200 μL无血清培养基，接种至被聚碳酸酯膜包被的Transwell小室的上室中，然后将上室置于含有700 μL 10%FBS培养基的下室（六孔板）中，于37℃恒温箱中培养24 h。培养结束后用棉棒擦除上室中未穿出细胞，经4%甲醛于室温下固定，再用0.1%结晶紫染色，流水清洗后室温干燥，最后在显微镜下观察，每个小室于10×显微镜下取3个独立视野拍照，计数穿出细胞进行统计学分析。该实验独立重复3次。

1.6 Western印迹实验 U87 MG和原代GBM细胞经设定浓度的单药和联合药物处理72 h，用胰酶消化收集细胞，离心去除上清液，将沉淀于混有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解1 h。总蛋白浓度依据BCA法测定。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检（SDS-PAGE）测IKBKE及Akt通路蛋白变化，具体过程如下：取等量蛋白样品，于6%、10%、12%的SDS-PAGE中电泳分离，然后将蛋白质转至PVDF膜（360 mA，60 min）。结束后，该膜经PBS洗涤5 min×3次，洗涤结束后将膜置于5%脱脂牛奶中，于37℃恒温箱中封闭1 h。封闭完成后，去除封闭液，用特定一抗于4℃环境中孵育过夜。次日于室温下复温1 h，回收一抗后，用PBS将PVDF膜洗涤5 min×3次，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗于室温下再孵育1 h。最后丢弃二抗，用PBS再次洗涤PVDF膜后，利用ECL法测定蛋白表达水平。其中以GAPDH为内参。

1.7 免疫组织化学染色（IHC） 裸鼠经颈椎脱臼法处死后，取出鼠脑标本固定于4%福尔马林中，石蜡包埋后做成5 μm切片。将石蜡切片置于60℃环境中烤片1 h，然后经二甲苯和梯度乙醇水化脱蜡。结束后于92～99℃柠檬酸钠溶液中抗原修复15 min，室温中冷却，然后将切片用PBS洗涤5 min×3次，再经3%H2O2于室温下孵育30 min以清除内源性过氧化物酶活性。结束后经PBS洗涤5 min×3次，切片经1%牛血清白蛋白（BSA）于37℃恒温箱中封闭30 min，最后经特定一抗于4℃孵育过夜。次日室温下复温1 h后回收一抗，PBS洗涤5 min×3次，再经二抗孵育1 h，结束后经DAB染色、苏木素复染，然后分化、反蓝、水化、封片。显微镜下观察、拍照进行统计学分析。

1.8 动物实验 本实验利用裸鼠颅内模型进行药物体内实验。4周龄雌性裸鼠（约10 g/只）购买于中国医学科学院血液病研究所。颅内裸鼠模型构建及处理过程如下：将感染荧光病毒的原代GBM细胞用立体定向仪于裸鼠前后囟中点偏右2 mm处注射入裸鼠颅内。7 d后，利用小动物活体成像系统测定裸鼠颅内肿瘤大小，记录数据。将裸鼠随机分配至3组，每组15只，分别为对照组、TMZ组、TMZ+amlexanox组。TMZ组裸鼠接受5 mg/（kg·d）TMZ处理，联合药物组接受5 mg/（kg·d）TMZ+100 mg/（kg·d）amlexanox处理，对照组接受DMSO处理。3组裸鼠接受药物处理5 d后休息2 d，接着再处理5 d，以此循环至实验结束。以后每周对裸鼠成像1次。4周后，每组处死3只裸鼠，取出鼠脑后固定于福尔马林，用于苏木素伊红（HE）染色和IHC实验。每组剩余裸鼠饲养至实验结束，用于动物生存分析。

1.9 统计学处理 用x±s表示所有实验数据。用Graphpad Prism 6软件进行统计学分析。One-way ANOVA法用于分析多组数据是否具有统计学意义。采用Kaplan-Meier法检验各组生存率差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 TMZ联合amlexanox显著抑制肿瘤细胞增殖 U87 MG和原代GBM细胞经不同浓度的单药或联合药物处理24、48、72 h。CCK-8结果显示，TMZ或amlexanox对肿瘤细胞增殖能力的抑制作用随药物浓度增加而增强（图1）。与其他3组比较，TMZ+amlexanox组U87 MG和原代GBM细胞增殖能力明显抑制（图1）。而且，TMZ组和amlexanox组U87 MG 72 h药物半抑制浓度（IC50）分别为200 μmol/L 和 600 μmol/L，二者联合处理后 IC50分别降至 130 μmol/L（TMZ） 和 180 μmol/L。TMZ+amlexanox组原代GBM细胞72 h药物IC50值也显著降低。依据IC50值，本研究分别选择TMZ:100μmol/L和 amlexanox：50 μmol/L 进行后续实验。

2.2 TMZ联合amlexanox能有效抑制Akt激活 Western印迹实验结果显示，无论是U87 MG细胞还是原代GBM细胞，不同处理方式均不能改变细胞中Akt和mTOR蛋白质表达量，但TMZ组p-Akt表达量轻度升高，amlexanox组IKBKE表达量明显降低。TMZ+amlexanox组U87 MG和原代GBM细胞中p-Akt和p-mTOR表达水平显著降低（图2）。

2.3 TMZ联合amlexanox能显著抑制细胞侵袭和迁移能力 划痕实验结果表明，TMZ+amlexanox组U87 MG和原代GBM细胞划痕愈合面积显著低于TMZ 组和 amlexanox组（P＜0.001，图 3A、2B），Transwell迁移实验结果也表明，TMZ+amlexanox组U87MG和原代GBM细胞24 h后穿出小室细胞数量显著低于 TMZ 组和 amlexanox组（P＜0.05，图 3C、D）。Transwell侵袭实验结果表明，TMZ+amlexanox组U87 MG和原代GBM细胞穿出数量显著降低（P＜0.01，图 3C、3D）。

2.4 TMZ联合amlexanox抑制裸鼠颅内肿瘤生长 动物实验结果如图4A、4B、4C所示，TMZ组裸鼠颅内肿瘤体积略小于对照组，而TMZ+amlexanox组裸鼠颅内肿瘤体积显著小于TMZ组和对照组，且TMZ+amlexanox组裸鼠生存中位数也显著高于TMZ组和对照组（31 d比25.5 d和21 d）。HE结果也提示，TMZ+amlexanox组裸鼠颅内肿瘤体积显著小于另外两组（图4D）。另外，与体外细胞实验结果一致，IHC结果表明，TMZ+amelexanx组p-Akt和p-mTOR在颅内肿瘤中表达水平明显降低（图4D）。

图1 TMZ联合amlexanox对U87 MG和原代GBM细胞增殖能力的影响Fig 1 Effect of TMZ combined with amlexanox on proliferation of U87 MG and primary GBM cells

图2 TMZ联合amlexanox对U87 MG和原代细胞中IKBKE、Akt、mTOR等蛋白表达的影响Fig 2 Effect of TMZ combinedwith amlexanox on the expression of IKBKE,Akt,mTOR and other proteins for U87 MG and primary GBM cells

图3 TMZ联合amlexanox对U87 MG细胞和原代细胞迁移和侵袭能力的影响Fig 3 Effect of TMZ combined with amlexanox on the migration and invasion of U87 MG and primary GBM cells

图4 TMZ联合amlexanox对裸鼠颅内肿瘤的影响Fig 4 Effect of TMZ combined with amlexanox on orthotopic intracranial tumors of nude mice

3 讨论

TMZ普遍用于胶质瘤治疗，诱导DNA加合物形成是TMZ产生细胞毒性最主要机制[14]。尽管TMZ能改善GBM患者预后，但易产生耐药性[15]。临床上迫切需要一种针对胶质瘤患者更有效的治疗措施。本研究利用一系列实验证明TMZ联合小分子抑制剂amlexanox，能有效抑制U87 MG细胞和原代GBM细胞增殖、侵袭和迁移能力，并能显著抑制裸鼠颅内肿瘤生长和延长裸鼠生存期。

耐药性的产生是治疗胶质瘤患者失败的最主要原因。Akt作为重要的细胞蛋白质，其异常激活参与多种细胞活动，如细胞增殖、生存、糖代谢等。日益增多的研究证实，Akt激活与TMZ耐药性相关，而且TMZ能诱导Akt异常激活更增加肿瘤细胞对TMZ耐药性[16-17]。大量研究已经证实，抑制Akt通路能降低肿瘤细胞对TMZ耐药性，增强其细胞毒性作用[18-22]。其中Bi等[19]证实Cordycepin能通过激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）和抑制Akt通路，抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡。Wu等[20]证实FK228能通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt/mTOR通路促进胶质瘤细胞凋亡，并抑制裸鼠颅内肿瘤生长。本研究也表明，TMZ联合amlexanox能显著抑制p-Akt和p-mTOR表达水平，进而抑制细胞增殖能力。Amlexanox作为IKBKE的选择性抑制剂，不仅能调节糖代谢[23]，还能通过抑制Hippo通路而发挥抗肿瘤作用[13]。另外，IKBKE在乳腺癌和小细胞肺癌中参与Akt的异常激活[16,24]。因此，本研究发现，amlexanox能增强TMZ对胶质瘤细胞毒性作用，可能与amlexanox抑制IKBKE活性而抑制p-Akt表达并逆转TMZ诱导Akt激活有关。

综上所述，本研究证实TMZ联合amlexanox能显著抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，并能显著抑制原代GBM细胞在裸鼠颅内成瘤。Amlexanox能降低肿瘤细胞对TMZ耐药性，增强TMZ细胞毒性作用，可能与amlexanox抑制IKBKE活性而部分逆转TMZ诱导Akt激活有关。这为TMZ联合小分子抑制剂治疗胶质瘤提供新的临床治疗思路。