己醛处理对黄金梨采后果心褐变的影响

赵欢欢，周宏胜，刘梦竹，罗淑芬，李鹏霞,3*

1(南京农业大学 食品科技学院，江苏 南京，210095)2(江苏省农业科学院 农产品加工所，江苏 南京，210014)3(江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京，210014)

黄金梨富含多糖、矿物质、维生素等多种人体所需的营养物质，并以其细腻多汁的口感深受消费者喜爱。在黄金梨大量上市销售期间经常暴露于常温环境中，而常温贮藏期间黄金梨极易发生果心褐变[1]，并会逐渐蔓延至果肉，降低其口感和商品价值，严重阻碍了黄金梨产业的发展。因此，研究梨果实的防褐变技术很有必要。

目前，一些研究人员对黄金梨贮藏期间防褐变方法进行了研究，赵猛等[2]研究了1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)与乙烯吸收剂对黄金梨的防褐效果的影响，得出0.5和1.0 μL/L的1-MCP处理均对黄金梨果心褐变具有抑制作用，乙烯吸收剂的作用可减少1-MCP对果实的伤害。石磊等[3]的研究表明，当黄金梨贮藏环境中O2和CO2浓度较高时，果心褐变比较严重，并且褐变的发生时间也较早。在较低CO2(1%)和O2(5%)条件下可以将黄金梨的贮藏期延长至180 d。郭艳明[4]研究了微波处理及抗氧化涂膜对黄金梨褐变的调控作用，得出缓慢降温条件下，对果实进行微波处理可以防止褐变。但是，目前对于黄金梨采后防褐变技术仍然较少。

己醛(hexanal)是一种已探明的植物内源性芳香物质，在李子[5]、黄瓜[6]、猕猴桃[7]、葡萄[8]等果蔬中均有检出。己醛已被MOHD等[9]的研究团队证明是一种有效的磷脂酶D(phospholipase D, PLD)受体抑制剂，能够显著降低PLD的转录表达，进而在膜脂代谢途径中抑制番茄的衰老。LANCIOTTI等[10]则认为己醛是通过显著抑制霉菌、酵母菌、嗜温和嗜冷菌的生长水平，从而抑制苹果片气调贮藏过程中的褐变进程。然而，己醛处理对黄金梨常温贮藏品质及膜脂代谢的影响目前尚未见报道。

本文采用5 μL/L己醛处理黄金梨果实，对黄金梨亮度、褐变指数、硬度、可溶性固形物、呼吸速率等品质指标进行分析，同时关注膜脂代谢的运行变化，旨在探讨己醛处理对黄金梨采后果心褐变的影响，为其应用推广奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用黄金梨采自江苏省南京市溧水基地，采摘成熟度均匀、无病虫害的果实，套果实网套后用纸箱包装运抵实验室进行处理。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

醋酸、CaCl2、蔗糖、MgCl2、KNO3,西陇化工股份有限公司;1,3-磷脂酰胆碱、雷氏铵、三氟化硼-甲醇、KOH、甘油、苄基磺酰氯,上海麦克林生化科技有限公司;CHCl3、HClO4、KCl,国药集团化学试剂有限公司;交链聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone, PVPP)、亚油酸钠，源叶生物；甲醇、H2SO4、乙醚,南京化学试剂股份有限公司;Tris、叠氮化钠、钒酸钠,北京索莱宝科技有限公司;β-巯基乙醇,北京盛科博源生物科技有限公司;醋酸钠,广东光华科技股份有限公司;二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT),翊圣生物;石油醚,北京长海化工厂;HCl,宏景化工;正己烷,广东省化学试剂工程技术研究开发中心;钼酸铵,安徽精钼化学试剂有限公司;FeSO4,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;MgSO4,上海统亚化工科技发展有限公司;NaCl,上海久亿化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯；油酸、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、棕榈酸、甲醇、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)均为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脂肪酶活力测定试剂盒,南京建成生物工程研究所。

1.2.2 主要仪器

PAL-1型数显手持折光仪, 日本 Atago 公司；FT-011手持硬度计，意大利 Affri 公司；TU-1810 紫外-可见分光光度计，北京谱析通用仪器；PL202-L型多功能酸度计、PL202-L型分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；3K15 高速冷冻离心机，Sigma公司；A11 Basic型液氮研磨器，广州艾卡仪器设备有限公司CR-400全自动色彩色差计，日本柯尼卡美能达公司。

1.3 实验方法

为筛选适宜的己醛处理浓度，采用2.5、5、10和20 μL/L的乙醛对黄金梨进行熏蒸，以无任何处理为空白对照(CK)，密闭熏蒸8 h后，解除密封进行2 h通风处理。将黄金梨随机装入21 L的带孔保鲜箱中，每处理设置3个重复。置于(20±1) ℃、85%～90%相对湿度条件下贮藏。20 d后，观察不同浓度己醛处理对黄金梨果心褐变的影响，由此筛选出合适的处理浓度。

研究适合浓度的己醛处理对常温贮藏期间黄金梨品质及膜脂代谢的影响，贮藏条件同上，贮藏期间每5 d取样1次，进行指标的测定。其中呼吸速率和乙烯释放量采用鲜样测定，其他指标测定所需样品均用液氮速冻后贮藏在-80 ℃冰箱中。

1.4 品质指标的测定方法

1.4.1 果实亮度及褐变指数的测定

亮度参考刘红艳等[11]的方法，利用全自动色差计测定黄金梨果实亮度，取果实最大横径处对向2个点，切去果皮进行测定，测30次取平均值，亮度用L*表示。褐变率按公式(1)计算：

(1)

果心褐变指数测定参考闫师杰[12]的方法，贮藏期间每5 d取15个果实，将果实沿着果心中心部位横切，观察果心横切面的褐变级别。褐变级别分为5个等级，无褐变为0级；轻微褐变为1级；轻微褐变至褐变部位占全部面积20%以下为2级；20%～50%为3级；褐变部位大于50%为4级。按照公式(2)计算褐变指数：

(2)

1.4.2 呼吸速率和乙烯释放量的测定

呼吸速率的测定参考高建晓等[13]的方法，略有改动。贮藏期间每5 d取15个果实，称重后平均置于3个4.5 L具孔乐扣保鲜盒中，用橡胶塞塞紧，在(20±1) ℃环境下密封闷气4 h后，用20 mL注射器抽取样气10 mL用于气相色谱仪的测定。样气经安捷伦7820型气相色谱仪测定，色谱条件：FID检测器，柱温80 ℃，外标法定量，每个处理重复3次。

乙烯释放量的测定参考NISHIKAWA[14]等的方法，略有改动。制备样气方法同呼吸速率的测定，色谱条件：FID检测器，柱温70 ℃。

1.4.3 硬度、可溶性固形物(total soluble solids,TSS)的测定

在果实最大横径处对角位置切去2个1 cm2果皮，用手持硬度计垂直匀速插入果肉中，读取硬度计上的数值，每个处理测定15个果实。

TSS的测定方法参考黎春红等[15]的方法，采用手持折光仪进行测定。

1.4.4 PLD活性的测定

参考SUTTLE等[16]的方法，略有修改。取2 g黄金梨果心样品，用8 mL 0.1 mol/L pH 5.6的醋酸缓冲液(含10 g/L)浸提，于4 ℃下为，10 000 r/min离心15 min(10 000 r/min)，取上清液即为待测粗酶液。

反应底液的制备：取40 mg 1,3-磷脂酰胆碱溶于50 mL乙醚，N2吹干后溶于0.1 mol/L pH 5.6的醋酸缓冲液中(含5 mmol/L DTT，1 mol/L CaCl2)，即得0.4 mg/mL的反应底液。

反应体系包含1 mL酶液和3 mL反应底液，置于520 nm下测定吸光值A1，将原体系置于28 ℃摇床上于黑暗条件反应1 h后，加入石油醚萃取3次，取水相，加入2 mL 10 g/L雷氏铵，10 000 r/min离心10 min,取沉淀溶解于5 mL丙酮中，测定反应体系在520 nm下的吸光值A2。以520 nm下每小时吸光值变化0.001为1个酶活力单位，用U/mg表示。

1.4.5 脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活力的测定

LOX活力测定方法参考AXELROD等[17]的方法，略作改动。粗酶液的制备：2 g冻样加入8 mL磷酸缓冲液(pH 7.8，含0.05 mol/L巯基乙醇)，充分混匀后浸提2 h，4 ℃ 10 000 r/min离心20 min，取上清液待测。反应体系总量为3 mL，包含2.9 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)，50 μL 10 mmol/L亚油酸钠，50 μL稀释3倍后的粗酶液。以2.95 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，50 μL 10 mmol/L亚油酸钠体系为空白。在30 ℃下保温反应，234 nm处进行扫描，以吸光值每分钟上升0.01为1个酶活力单位，用U/mg表示。每个处理重复3次。

1.4.6 脂肪酶(lipase,LPS)活力的测定

脂肪酶活力采用南京建成公司生产的脂肪酶活力测定试剂盒进行测定。前期制备200 g/L上清液，浸提液为0.2 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液(含0.05 mol/L巯基乙醇)。

1.4.7 脂肪酸组成及不饱和指数的测定

参考LIN等[18]的方法，略有改动。5 g冻样加入10 mL抽提液，摇匀后加入10 mL 0.1 mol/L HCl，4 000×g离心10 min，收集有机相后置于N2气氛中吹干，蒸干物质与1 mL三氟化硼-甲醇共同沸腾10 min，用正己烷提取沸腾后的液体，重复3次后氮气吹干，蒸干物重新溶于200 μL氯仿，过0.22 μm滤膜后等待上机测定。抽提液为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(0.1 mol/L HCl)=200∶100∶1混合液。

脂肪酸不饱和度用不饱和指数来表示。参考罗淑芬等[19]的方法，不饱和指数(index of unsaturated fattyacid,IUFA)按公式(3)计算:

IUFA=1×油酸含量(%)+2×亚油酸含量(%)+3×亚麻酸含量(%)

(3)

1.5 数据统计

本研究所有数据处理均用Excel完成，结果以平均值±标准差表示，图表采用Origin 9.0软件绘制，显著性采用SAS软件进行分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 己醛浓度筛选

从图1可以看出，5 μL/L己醛熏蒸的黄金梨在货架第20天时果心的褐变程度最小，其他处理都出现了不同程度的果心褐变。因此，选择5 μL/L己醛对黄金梨进行处理。

图1 不同浓度的己醛熏蒸对黄金梨感官品质的影响Fig.1 Effects of different concentrations of hexanal fumigation on sensory quality of Whangkeumbae pears

2.2 己醛处理对常温贮藏黄金梨果实品质的影响

2.2.1 己醛处理对常温贮藏黄金梨果实亮度及褐变率的影响

黄金梨贮藏过程中，果肉亮度和果心褐变指数是衡量保鲜贮藏品质优劣的重要指标之一，也是判断其贮藏寿命的直观依据。由图2-a可知，贮藏期间，CK和己醛处理的黄金梨果肉亮度均呈现波动下降的趋势，且CK组下降幅度较己醛处理组。贮藏10 d后，己醛处理组果肉的亮度显著高于CK组(P<0.05)。由此可见，己醛处理能够有效延缓贮藏后期梨果肉亮度的降低。

图2 己醛处理对黄金梨果实亮度及褐变指数的影响Fig.2 Effects of hexanal treatment on L* and browning index of Whangkeumbae pears注：*表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)(下同)

图2-b显示，在整个常温贮藏期间，果心褐变呈逐渐上升趋势，且 CK组的黄金梨果心褐变指数均显著高于己醛处理组(P<0.05)，说明己醛处理能够显著抑制黄金梨果心褐变指数升高。

2.2.2 己醛处理对常温贮藏黄金梨呼吸速率和乙烯释放量的影响

黄金梨属呼吸跃变型果实，其呼吸速率直观地反映了果实的生理状态。由图3-a可知，黄金梨在整个常温贮藏期间呼吸速率总体呈现先上升后下降的趋势，且在第15天达到呼吸高峰。整个贮藏期间，除第20天外，己醛处理组黄金梨的呼吸速率皆显著低于CK组(P<0.05)，可见己醛处理明显抑制了黄金梨的呼吸速率。由图3-b可见，与呼吸速率相同，在整个贮藏期间，CK和己醛处理的黄金梨乙烯释放量的变化趋势为先升高后下降，在第15天到达高峰。在贮藏10、15、25 d时，CK组黄金梨乙烯释放量显著高于己醛处理组(P<0.05)，说明己醛处理在一定程度上可有效抑制黄金梨采后乙烯的释放。

图3 己醛处理对黄金梨呼吸速率和乙烯释放量的影响Fig.3 Effects of hexanal treatment on respiration rate and ethylene release of Whangkeumbae pears

2.2.3 己醛处理对常温贮藏黄金梨硬度和TSS含量的影响

硬度和可溶性固形物是表征黄金梨果实品质的重要指标，TSS含量反映了果实营养物质的积累和消耗情况。由图4-a可知，在整个常温贮藏期内，黄金梨果实硬度呈现下降趋势，尤其贮藏中期即第10、20天，硬度下降较快，经己醛处理组硬度下降较CK组缓慢，但与CK组仅在第15天时呈显著差异(P<0.05)。在整个贮藏期间，己醛处理组和CK组果实的TSS含量总体均呈现先升高后降低的趋势(图4-b)。CK组黄金梨在贮藏15 d时达到TSS积累峰值，己醛处理组推迟了TSS积累高峰的到来。在贮藏至15 d后，CK组TSS含量迅速下降，而己醛处理整体下降缓慢，且在20～25 d期间显著高于CK组(P<0.05)，可见己醛处理可延缓黄金梨贮藏后期可溶性固形物的下降，但对其硬度影响不大。

图4 己醛处理对黄金梨硬度及可溶性固形物含量的影响Fig.4 Effects of hexanal treatment on firmness and TSS of Whangkeumbae pears

2.3 己醛处理对常温贮藏黄金梨PLD活力的影响

PLD能够水解磷脂，释放磷脂酸，是维持细胞膜流动性的关键酶。如图5所示，黄金梨在常温贮藏期间PLD活力整体呈波动变化的趋势。在整个贮藏期内，己醛处理组PLD活力始终显著低于CK组(P<0.05)。尤其在15 d时CK组黄金梨果心PLD活力达到峰值，为3.04 U/g，是同时期己醛处理黄金梨的1.9倍。这说明己醛处理对黄金梨PLD具有很好的抑制效果。

图5 己醛处理对黄金梨磷脂酶活力的影响Fig.5 Effects of hexanal treatment on PLD activity of Whangkeumbae pears

2.4 己醛处理对常温贮藏黄金梨LOX活力的影响

LOX是参与果实膜脂代谢的关键酶。由图6可知，在黄金梨常温贮藏期间，果心LOX活力总体呈现先上升后小幅下降的趋势，且CK与己醛处理组具有相同的变化趋势。在整个贮藏期内，己醛处理组LOX活力在10～20 d期间显著低于CK组(P<0.05)，这表明己醛处理整体上能够有效抑制常温贮藏中期黄金梨果心LOX活力。

图6 己醛处理对黄金梨脂氧合酶活力的影响Fig.6 Effects of hexanal treatment on LOX activity of Whangkeumbae pears

2.5 己醛处理对常温贮藏黄金梨LPS活力的影响

LPS可将脂肪水解成甘油和脂肪酸，从而影响黄金梨膜脂代谢过程。从图7可知，在常温贮藏期间黄金梨果心LPS活性总体呈现先上升后下降的趋势。贮藏5 d后，CK组的黄金梨LPS活力显著高于己醛处理组(P<0.05)，尤其在15 d时CK组果心LPS活力是己醛处理组的1.21倍。上述结果表明，己醛处理能够在常温贮藏期间抑制脂肪酶活力地上升。

图7 己醛处理对黄金梨脂肪酶活力的影响Fig.7 Effects of hexanal treatment on LPS activity of Whangkeumbae pears

2.6 己醛处理对常温贮藏黄金梨脂肪酸组成的影响

脂肪酸是组成生物细胞膜的重要成分，其组成会影响细胞膜的稳定性。黄金梨果心脂肪酸主要由棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)以及亚麻酸(C18∶3)等组成。从图8可知，未经处理的黄金梨果心棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸以及亚麻酸的含量分别为1.290 0、0.577 5、17.856 3、6.590 0以及5.337 5 μg/g。可见油酸是黄金梨果心膜脂肪酸的主要成分，其含量的高低直接影响了黄金梨常温贮藏品质。

由图8-a可知，在常温贮藏期间，CK黄金梨果心棕榈酸含量在贮藏15 d时达到峰值，随后缓慢下降；而己醛处理组呈现不断上升的趋势。在贮藏5 d后己醛处理组棕榈酸含量显著低于CK组(P<0.05)。由图8-b可以看出，黄金梨果心硬脂酸含量整体呈现不断上升的趋势。在整个贮藏期，CK组黄金梨果心硬脂酸含量显著高于己醛处理(P<0.05)。图8-c表明，黄金梨果心油酸含量总体呈现先上升后下降的趋势，且在第10天时达到峰值，且在贮藏10 d后CK组显著低于己醛处理组。由图8-d可知，对照组亚油酸的含量在贮藏前期(0～15 d)呈现下降趋势，贮藏后期(15～25 d)含量有所上升，己醛处理组亚油酸含量总体变化不大。在贮藏中后期(10～25 d)，己醛处理组亚油酸含量均显著高于CK组(P<0.05)。由图8-e可知，亚麻酸含量总体呈现下降的趋势，在整个贮藏期己醛处理组亚麻酸含量均高于CK组，但仅在第10天时具有显著性差异(P<0.05)。以上结果说明，己醛处理可有效延缓油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的氧化和棕榈酸、硬脂酸等饱和脂肪酸含量积累。

2.7 己醛处理对常温贮藏黄金梨IUFA和脂肪酸比值的影响

由图9-a可知，随着贮藏时间的延长，黄金梨果心的IUFA水平呈现不断下降的趋势，说明不饱和脂肪酸在贮藏过程中被不断氧化，这也是造成果心褐变的一个重要原因。在整个贮藏期，己醛处理组IUFA值始终显著高于CK组(P<0.05)。由图9-b可知，黄金梨果心膜脂不饱和脂肪酸∶饱和脂肪酸(unsaturated∶saturated,U∶S)同样呈现不断下降的趋势。己醛熏蒸处理组U∶S值显著高于CK组(P<0.05)，这说明己醛可有效抑制黄金梨果实不饱和脂肪酸氧化。

图9 己醛处理对黄金梨脂肪酸IUFA与U∶S的影响Fig.9 Effects of hexanal treatment on IUFA and the ratio of unsaturated fatty acid to saturated fatty acid (U∶S) of Whangkeumbae pears

3 结论与讨论

黄金梨贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，其品质会有所下降。具体表现在果实颜色变暗、呼吸速率加快、乙烯释放量升高、果粒软化、可溶性固形物含量升高、果心褐变等，其中最严重的问题就是黄金梨果心的褐变。韩雅萱[20]发现1-MCP处理可显著抑制果心、果肉褐变的发病率、病情指数、乙烯释放速率、呼吸强度等指标，由此延缓梨果心的褐变。李少华[21]开发了一种壳聚糖-抗褐变剂-植物精油的复合型涂膜保鲜液，将其涂抹到柠檬鲜切片上，可有效减缓其酚酸、过氧化物酶和多酚氧化酶等指标变化，由此抑制柠檬切片酶促褐变的发生。在本实验中发现己醛处理可有效降低黄金梨采后呼吸速率、乙烯释放量，果肉TSS的消耗，以及维持果肉和果心的色泽，由此抑制果心褐变。朱萍[22]的研究发现乙醛熏蒸能显著延缓鲜切菠萝在贮藏过程中的褐变和软化现象。

采后梨贮藏过程中细胞膜发生氧化，膜脂过氧化逐渐加剧，由此造成细胞膜系统遭受破坏，导致细胞内酚类物质泄露，与空气中的氧气接触，发生酶促褐变，导致果心褐变，因此防止细胞膜脂过氧化是延缓其采后褐变的关键。在膜脂过氧化过程中，主要体现为不饱和脂肪酸发生氧化，而在这个过程中，PLD、LPS等酶发挥了关键作用，这些酶活性的增强会加剧膜脂过氧化速度。本实验发现己醛处理有可有效抑制PLD、LPS、LOX等酶的活性，由此抑制脂肪酸的氧化，延缓膜脂过氧化进程，己醛处理组提高了IUFA和U∶S也证实了这一推论。LIN等[23]也发现，没食子酸丙酯抑制了龙眼的PLD、LPS、LOX等酶活性，并抑制脂肪酸的氧化，由此抑制了膜脂过氧化，从而延缓了其果实的采后褐变。此外，研究发现己醛是黄金梨PLD酶较好的抑制剂，这与JINCY等[24]和 PADMANABHAN等[25]对芒果和甜樱桃的研究结果类似。

综上所述，己醛处理能够通过维持较低的呼吸速率和乙烯释放量，减少TSS的消耗，保持良好的果肉色泽来保证黄金梨果实贮藏品质，并能通过抑制膜脂代谢途径中关键酶，尤其是PLD的活性，来抑制不饱和脂肪酸的氧化，由此保护细胞膜系统不遭受破坏，从而抑制黄金梨果心产生褐变。