L-精氨酸/L-赖氨酸对乳清蛋白凝胶质构和持水性的影响

王耀松，马天怡，张唯唯，黄梅桂，应瑞峰，胡荣蓉，唐长波*

1(南京林业大学 轻工与食品学院，江苏 南京， 210037)2(肉品加工与质量控制教育部重点实验室，南京农业大学 食品科学技术学院，江苏 南京， 210095)

精氨酸和赖氨酸都是具有生理活性的碱性氨基酸[1]，等电点分别为10.76和9.74。其来源广泛、经济性高，无毒害作用，可作为添加剂加入到食品体系中[2]，以提高食品物理化学稳定性和各类食品加工功能性。前期研究发现精氨酸及其盐酸盐是通过不同的分子机制抑制蛋白分子聚集，维系蛋白稳定性[3-5]，而赖氨酸通过诱导改变蛋白构象和带电量[6]来抑制蛋白聚集。它的带电状态抑制热诱导蛋白聚集，再结合其他调控(如pH)可获得有利稳定性的聚集体[7]。蛋白聚集现象在其加工过程中一直存在[8]，降低蛋白稳定性，可能损害蛋白各类功能性。在应用体系中，研究发现赖氨酸、精氨酸与猪肌纤维蛋白酸性氨基酸残基相互作用而抑制蛋白聚集、提高溶解性[9,10]，可显著改善猪肉香肠持水性[11]。此外，赖氨酸还可以降低猪肉肌纤维凝胶蒸煮损失[12]、提高乳化香肠的物理稳定性[13]、改善鱼糜凝胶性[14]和鸡肉热稳定性[15]。精氨酸则可提高鸡肌肉的持水性[16,17]。这2种氨基酸亦可通过改变分子间作用力而改变凝胶特性和微观结构[18]，降解鸡肌纤维蛋白亚基组分而提高鸡肉的嫩度[19]，还可以通过增加静电排斥效应而提高鸡肉香肠的乳化性[20]、质地流变性、乳化稳定性和微观结构等特性[21]。

以上这些研究表明在一定的pH下，精氨酸和赖氨酸具有改造食品蛋白功能性的能力，然而研究缺少从酸性到碱性跨度、并在同体系下对蛋白功能性影响的研究。另外，不少研究也表明温度和pH等因素[22-23]影响蛋白的聚集过程。为此，本实验结合碱性氨基酸的等电点因素，选择在pH在2.0、5.2、7.59、9.74和10.76下制备热诱导凝胶，探讨精氨酸和赖氨酸改造乳清蛋白基质凝胶功能性的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-精氨酸、L-赖氨酸(分析纯)，上海生工生物技术有限公司；乳清蛋白WPI-90，美国加州Hilmar公司；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计(FE28)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；电热恒温水浴锅(DK-S26)，上海精鸿实验设备有限公司；超微量分光光度计(NanoDrop2000C)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；多功能酶标仪(SpectraMax®i3x)，美谷分子仪器(上海)有限公司；Zeta电位仪(Nanoplus 2)，麦克默瑞提克(上海)仪器有限公司；纳米激光粒度分布仪(BT-90)，丹东百特仪器有限公司；质构仪(TA-XT plus)，英国Stable Micro Systems公司；紫外可见分光光度计(UVmini-1240)，岛津企业管理(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1L-精氨酸、L-赖氨酸与乳清蛋白混合溶液制备

在新鲜制备的质量浓度120 g/L乳清蛋白溶液中分别加入不同质量的L-精氨酸、L-赖氨酸，使氨基酸最终质量浓度分别为1和3 g/L，充分搅拌均匀。不加入氨基酸的乳清蛋白溶液为对照。以上5类样品，每种分成5组，使用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液将以上每类中5组样品的pH再分别调至2.0、5.2、7.59、9.74和10.76，放置4 ℃下备用。

1.3.2 蛋白粒径和ζ-电位测定

根据WANG等[24]的方法略作修改。用去离子水将新鲜制备的蛋白储备液均稀释到10 g/L，测定其粒径大小及ζ-电位。

1.3.3 紫外光谱和荧光光谱测定

根据WANG等[25-26]的方法略作修改。使用与储备样品相同pH的蒸馏水将蛋白样品稀释到2 g/L，再应用超微量分光光度计测定已稀释好的样品在240～380 nm波长下的吸光度。应用多功能酶标仪扫描上述稀释蛋白溶液的荧光强度，其激发光和发射光波长的狭缝设置为5 nm，激发波长设置为280 nm，测定300～500 nm下荧光强度。

1.3.4L-精氨酸、L-赖氨酸清蛋白凝胶的制备

用内径为35 mm、高度为30 mm小烧杯加入25 mL上述不同质量浓度的L-精氨酸、L-赖氨酸及5个pH的乳清蛋白溶液，使用保鲜膜封口；90 ℃水浴加热30 min后取出，冰水冷却至室温，放置4 ℃冰箱中12 h，凝胶待用。

1.3.5 蛋白凝胶质构测定

采用质构仪测定凝胶质构特性。探头测试前、测试及测试后的速率分别设置为1.0、2.0和5.0 mm/s；下压距离为10.0 mm；触发力为5.0 g；凝胶形状为圆柱形(35 mm×30 mm)。凝胶质地以Bourne定义[27]计算其硬度、弹性、黏聚性、胶黏性、咀嚼性和回复性。

1.3.6 化学作用力测定

参照CHAWLA等[28]的方法测定0(对照组)、3 g/LL-精氨酸、L-赖氨酸/乳清蛋白混合凝胶中的化学作用力。将4种溶剂分别标记为S1、S2、S3、S4，其中S1：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl；S2：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸钠；S3：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸钠和8 mol/L尿素；S4：pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl含有10 g/L十二烷基硫酸钠、8 mol/L尿素和体积分数2% β-巯基乙醇。每份称取0.2 g的凝胶，分别加入8 mL上述溶液，在室温条件下摇匀静置过夜，采用双缩脲法测定溶解出的蛋白质含量，其溶解率为溶出蛋白所占凝胶块内总蛋白的比例(%)。

1.3.7 持水性测定

参考WANG等[29]的方法，取一定质量的乳清蛋白凝胶置于含滤纸的离心管中，3 000×g离心20 min，再称质量。持水性(water holding capacity,WHC)的值按公式(1)计算：

(1)

式中:m1,凝胶、离心管和滤纸质量，g；m2,离心后去除凝胶的质量，g；m,离心管与滤纸的质量，g。

1.4 数据处理

使用Statistix软件进行统计分析，显著性水平设为α=0.05；采用LSD检验数据间的差异显著性，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 L-精氨酸/L-赖氨酸诱导乳清蛋白粒径大小和ζ-电位的变化

蛋白粒径及其带电性影响蛋白分子聚集和稳定性，对蛋白的凝胶行为有着重要影响[30]。图1中乳清蛋白在等电点(isoelectric point,pI)5.2时，其粒径大小显著大于其他pH条件下的粒径尺度，平均在1 700 nm左右；在其他pH条件下，蛋白粒径大小并不随着pH的变化而发生显著性改变，基本保持在380～410 nm。不同质量浓度的L-精氨酸和L-赖氨酸的加入，未引起蛋白粒径大小的显著改变；然而在同一pH条件下，L-赖氨酸比L-精氨酸更能降低蛋白粒径大小，并随着氨基酸质量浓度的升高而进一步降低蛋白粒径。对于聚集体的另一个重要参数是ζ-电位，因为组成聚集体的蛋白是由几类蛋白组成，在等电点时聚集体仅仅带有极少量的负电；在低于等电点pH时，加入氨基酸显著提高蛋白聚集体的带正电量(除质量浓度3 g/LL-赖氨酸外)；在pH>等电点时，聚集体的蛋白带电性为负电,带电量显著上升(P<0.05)。在pH 7.59下的1 g/LL-精氨酸以及在pH 9.74下的3 g/LL-精氨酸能够显著降低聚集体带电量(P<0.05)，而其他pH下氨基酸的加入则对聚集体带电量无显著影响。为此，乳清蛋白在远离等电点时能形成较小的聚集体，显著提高带电性及带电量；L-精氨酸、L-赖氨酸可进一步降低聚集体的大小和带电量，与之前报道一致[31]。

a-粒径;b-ζ-电位图1 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸对乳清蛋白粒径大小和ζ-电位的影响Fig.1 Effect of L-Arg/L-Lys on the particle size and ζ-potential of whey protein at various pH values

2.2 L-精氨酸/L-赖氨酸诱导乳清蛋白结构的变化

本试验利用具有芳香族氨基酸的紫外吸收光谱和荧光吸收光谱行为来反映乳清蛋白结构变化[32]，结果如图2所示。在同一pH条件下，乳清蛋白的紫外吸收光谱与其荧光吸收光谱的变化规律类似。在pH 2.0时，随着L-精氨酸和L-赖氨酸添加量越大，2种光谱的吸收强度越大，1 g/LL-精氨酸处理样品的光谱吸收强度高于3 g/LL-赖氨酸处理样品的光谱强度；在pH 5.2时，样品的2种光谱吸收强度却随着L-精氨酸、L-赖氨酸加入量的升高而降低，此时L-赖氨酸处理的乳清蛋白光谱吸收强度要高于L-精氨酸处理的；在碱性范围(pH 7.59～10.76)内，乳清蛋白的2种光谱吸收强度却进一步降低；在同一pH下，L-精氨酸处理要比L-赖氨酸处理的蛋白样品吸收强度低；也就是说，L-精氨酸可能比L-赖氨酸对乳清蛋白结构变动的影响大。总之，经1～3 g/LL-精氨酸和L-赖氨酸处理的乳清蛋白在酸性、碱性条件下的结构变化行为不同。

a，b-pH 2.0；c，d-pH 5.2；e，f-pH 7.59；g，h-pH 9.74；i，j-pH 10.76图2 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸与乳清蛋白相互作用的紫外吸收光谱和荧光光谱Fig.2 Ultraviolet absorption and fluorescence spectra of the interaction between L-Arg/L-Lys and whey protein at various pH values

2.3 L-精氨酸/L-赖氨酸对乳清蛋白在不同pH下所成凝胶形貌和质构的影响

凝胶性是蛋白众多功能性之一，赋予蛋白质地并承载着蛋白其他功能性(如持水性)。由平视图(图3-a)和俯视图(图3-b)可知，在不同pH、不同质量浓度L-精氨酸和L-赖氨酸的条件下，乳清蛋白均能形成质构比较完整的凝胶，并且这些凝胶在“站立”时能保持凝胶形状而不出现明显的坍塌现象。在pH 2.0时，处理组较对照组，蛋白所成凝胶的完整性得到显著提高；在蛋白等电点处，L-赖氨酸处理的蛋白所成凝胶表面粗糙，而L-精氨酸处理组的凝胶则相对光滑、细腻。这可能是加入HCl调节pH时形成不同能力的pH缓冲对，也就是说H+释放速率不同，影响蛋白聚集(自组装)速率和模式[33-34]，从而形成不同粗糙度的结构。在pH 7.59和pH 9.74时，对照组凝胶在自身重力作用下有一定的横向膨胀性，而处理组的凝胶均没有明显变化。在较高(pH 10.76)条件下，不同处理的蛋白所形成的凝胶均能完整地保持形状。

图3 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸加入乳清蛋白后所成热诱导凝胶的形貌图Fig.3 Visible appearance of heated whey protein gels after L-Arg and L-Lys additions formed at various pH values

此外，不同质量浓度的L-精氨酸、L-赖氨酸处理的乳清蛋白在不同pH下所成凝胶的颜色变化呈现类似的规律。在乳清蛋白等电点时，对照组与处理组的乳清蛋白所成凝胶均为白色；在酸性条件下(pH 2.0)，乳清蛋白所成凝胶颜色则为灰黄色并伴有一定的浑浊，而在碱性条件下所形成的凝胶颜色则是亮黄色，其黄度值随着pH升高而增加，在酸性、碱性条件下形成的凝胶在颜色方面有着明显差异。L-精氨酸、L-赖氨酸的加入对凝胶的颜色没有显著影响。凝胶浊度的变化可能是蛋白在酸性、碱性条件的分子排布不同，而颜色的变化可能归结于半胱氨酸的消除反应所形成的无机和有机聚硫化合物[35]。

凝胶的全质构结果如图4所示。在pH 2.0时，所有样品形成的凝胶强度均无显著性差异，其凝胶硬度在蛋白等电点时都达到最大。在等电点处，蛋白分子因不带电而致使在形成凝胶后缺少静电相互作用，形成的球形聚集体有极大的断裂脆性[36]，从而在二次下压过程中表现出较差的弹性、黏聚性和回复性(图4-b、c和f)。在低pH缺少巯基/二硫键交换反应，而提高pH则能促进这种反应[30]。

a-硬度；b-弹性；c-黏聚性；d-胶黏性；e-咀嚼性；f-回复性图4 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸对乳清蛋白所成凝胶质地特性的影响Fig.4 Effect of L-Arg/L-Lys on texture of whey protein gels formed at various pH values

加入碱性氨基酸后，在等电点处1 g/LL-精氨酸/L-赖氨酸显著提高凝胶强度(P<0.05)。随后凝胶硬度先降低后又在pH 10.76处显著上升(P<0.05)(图4-a)。胶黏性与凝胶硬度的变化规律类似(图4-d)。在等电点处所形成的凝胶，弹性值最低(图4-b)，当pH远离等电点时，凝胶弹性开始显著提高，特别在pH 7.59和pH 9.74，1 g/LL-赖氨酸对凝胶的弹性提升最为显著(P<0.05)。对于凝胶的黏聚性(图4-c)，总体趋势上其值随着pH上升而显著上升，特别在pH 2.0和pH 7.59时，3 g/LL-精氨酸/L-赖氨酸能够显著提高凝胶黏聚性(P<0.05)。凝胶的回复性(图4-f)与凝聚性变化类似；在pH 7.59时，3 g/LL-精氨酸/L-赖氨酸处理则显著高于其他处理组，但随后随着pH升高而略有下降。咀嚼性也是随着pH的升高而升高(图4-e)；在等电点、pH 7.59时,L-精氨酸的加入引起咀嚼性显著变化(P<0.05)。这2种质量浓度的氨基酸在pH 9.74时均显著降低凝胶的咀嚼性(与pH 7.59相比)，随后在pH 10.76时又上升至与pH 7.59时的咀嚼性相当。

从以上变化可知，凝胶的质构特性主要受制于pH变化，而L-精氨酸和L-赖氨酸在pH基础上加入适当浓度则可进一步改善这些质构特性；在一些研究中认为这主要归结于精氨酸、赖氨酸与蛋白质残基静电作用而改变凝胶性能[11,16-17]。

2.4 L-精氨酸/L-赖氨酸诱导乳清蛋白热凝胶内化学作用力的变化

研究测定了疏水作用力、氢键和二硫键3种作用力，结果如图5所示。在对照组样品中，二硫键在pH 2.0～9.74形成凝胶中的作用表现越来越强；氢键在酸性条件下所成凝胶中的作用也较大；疏水作用力则在“极端pH”下(pH 2.0和pH 10.76)所成凝胶中的作用较大，特别是在pH 10.76时是形成凝胶中的主要作用力。

加入L-精氨酸的凝胶中，氢键在所有pH条件下的凝胶中都是主要作用力，二硫键在等电点(pH 5.2)及较高pH(pH 9.74和pH 10.76)下所成的凝胶中也发挥着重要作用，而疏水作用力却随着pH升高而一直降低且比较低，这可能与L-精氨酸促进蛋白溶解相关[6]。除pH 2.0外的其他pH条件下，加入L-赖氨酸所成凝胶中的二硫键都发挥着重要作用；氢键仅在等电点和pH 7.59条件下所成凝胶中有一定的作用；而疏水作用力随着pH升高而一直上升且作用越来越大；pH 2.0时，加入的L-赖氨酸所成凝胶中的氢键、疏水作用力及二硫键作用极小，这可能是静电作用力在凝胶中起到主要支配作用[37]。在相同pH下，L-精氨酸的加入显著提高凝胶中的氢键作用、降低二硫键作用(pH 7.59)以及疏水作用力(pH 10.76)，却提高疏水作用力(pH 5.2和pH 7.59)。相比之下，L-赖氨酸的加入则提高凝胶中的疏水作用力和二硫键作用(除pH 2.0外)，但降低氢键作用(pH 2.0和pH 5.2)。

图5 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸对乳清蛋白所成凝胶化学作用力的影响Fig.5 Effect of L-Arg/L-Lys on the chemical forces involved in whey protein gels formed at various pH values

2.5 L-精氨酸/L-赖氨酸诱导乳清蛋白热凝胶持水性的变化

由图6可知，在等电点(pH 5.2)时，凝胶的持水性最差。因为此时蛋白分子几乎不带电，缺少分子间的相互作用而形成的凝胶，其分子网络的物理性截留水、蛋白分子与水分子间的水化作用而形成的单层或多层水的形成能力较差。在pH 2.0时，加入的L-精氨酸和L-赖氨酸将持水性从70%提高至75%左右。尽管等电点时蛋白质不带电，但加入的1 g/LL-精氨酸和L-赖氨酸能够显著提高凝胶的持水性；而较高质量浓度的L-精氨酸和L-赖氨酸则对此时凝胶的持水性无任何作用。在pH 7.59时，加入L-精氨酸和L-赖氨酸，无论质量浓度高低均能显著提高凝胶的持水性，达82%左右(P<0.05)。在pH 9.74时，L-赖氨酸处理使凝胶持水性开始显著下降(与pH 7.59相比)，而L-精氨酸处理的凝胶持水性保持稳定(相比对照组则显著提高凝胶持水性)。在pH 10.76时，除添加3 g/LL-精氨酸显著高于同pH下其他凝胶的持水性外，这些处理及对照组凝胶的持水性与pH 9.74时L-精氨酸处理相当。加入碱性氨基酸后凝胶持水性有所提高，在肌球蛋白凝胶体系中也发现类似现象，其主要原因是碱性氨基酸抑制蛋白聚集、促进其溶解而增大比表面积和水化能力[6,10,12,18]。

图6 不同pH下L-精氨酸/L-赖氨酸对对乳清蛋白所成凝胶持水性的影响Fig.6 Effect of L-Arg/L-Lys on water holding capacity of whey protein gels formed at various pH values

3 结论

向乳清蛋白中加入L-精氨酸和L-赖氨酸并结合不同pH处理，可形成多功能性、颜色不同的热诱导凝胶。L-精氨酸/L-赖氨酸在pH对乳清蛋白结构与功能性改变的基础上，可进一步通过降低蛋白粒径大小、改变ζ-电位，调节蛋白结构伸展性和分子聚集行为，重排凝胶中蛋白分子间的化学作用力，显著提高蛋白凝胶的质构特性和持水性。在极酸条件下形成外观不完整的浊黄色凝胶，而在碱性条件下形成外观完整的亮黄色凝胶，并且黄度颜色随pH升高而明显增加；在蛋白等电点时,蛋白形成外观完整的乳白色、有析水现象的凝胶；加入L-精氨酸/L-赖氨酸可提高凝胶的外观完整性，但对其颜色无显著影响。为作为蛋白凝胶功能修饰的添加剂应用在食品体系中提供理论依据。