RAC1通过调节紧密连接蛋白1分布影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭

张璐玢，邹雪琴，张鳅丹，高淑君，刘雪，潘玲丽，赵杨静，梁秀婷，王荟,3，朱彦玲，邵启祥,3

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属徐州医院妇产科，江苏 徐州 221005； 3. 江苏省检验医学重点实验室，江苏 镇江 212013)

卵巢上皮细胞癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是高死亡率的妇科恶性肿瘤，在癌症早期常迅速转移至腹膜导致跨体腔转移，严重影响女性的身心健康[1]。小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1，RAC1)是Rho蛋白家族成员之一，通过在活性状态GTP-RAC1和非活性状态GDP-RAC1间相互转换，在肿瘤中发挥重要的分子开关作用[2]。作为细胞骨架的调节因子，RAC1可调节细胞骨架重塑、黏附、迁移、侵袭和基因转录调控等[3]。研究发现[4]，RAC1在EOC患者组织标本和细胞系中高表达，其表达水平与血清CA125、肿瘤病理分型和术后残余肿瘤大小呈正相关，并预示患者不良预后，还通过上调波形蛋白和下调E-钙黏蛋白促进上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)。

EMT是上皮细胞失去顶端-基底极性和细胞间黏附，发生间质细胞表型转变的过程，常伴随着上皮细胞间连接减弱、迁移和侵袭能力增加[5]。紧密连接蛋白1(tight junction protein 1，TJP1)是EMT过程中上皮样细胞的标志物，是最早被鉴定出的细胞紧密连接相关蛋白，敲除TJP1会破坏细胞间的紧密连接[6]。鉴于TJP1是参与调控细胞EMT的重要分子，与肿瘤细胞的迁移和侵袭密切相关，本研究通过构建稳定敲减RAC1的卵巢癌细胞系，观察敲减RAC1对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响，并探究RAC1对TJP1表达和分布的调节作用，为阐明卵巢癌转移的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人卵巢癌细胞系OVCAR3和人胚胎肾细胞系HEK-293T由江苏大学医学院周小明教授惠赠；人卵巢癌细胞系SKOV3由江苏大学医学院卢小东教授惠赠；所有细胞均采用含10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素的高糖DMEM，置5% CO2、37 ℃恒温培养箱培养、传代。

1.1.2 主要试剂 DMEM和胎牛血清(美国Gibco公司)；嘌呤霉素和聚凝胺(上海YEASEN公司)；限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、NcoⅠ和T4DNA连接酶(美国NEB公司)；PCR产物纯化、胶回收和质粒抽提试剂盒(上海生工公司)；RIPA裂解液和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体(上海碧云天公司)；鼠抗人RAC1抗体、基质胶和Transwell小室(美国BD公司)；兔抗人TJP1抗体(美国Proteintech公司)；鼠抗人GAPDH抗体(南京贝迪公司)；HRP偶联的抗小鼠/兔IgG(美国Cell Signal Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立稳定敲减RAC1基因的卵巢癌细胞系

1.2.1.1RAC1shRNA目的片段的获得 在美国Sigma Aldrich公司网站(https:∥www.sigmaaldrich.com)检索获得一对经过验证的人RAC1shRNA序列，正义链为5′-CCGGCGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCGTTTTTG-3′，反义链为5′-AATTCAAAAACGCAAACAGATGTGTTCTTAACTCGAGTTAAGAACACATCTGTTTGCG-3′，由上海生工生物工程公司合成。按照下述体系和条件退火：10×NEB 缓冲液 5 μL，正义链和反义链各5 μL，无核酸酶水35 μL，95 ℃变性4 min，70 ℃退火10 min，缓慢降至室温。

1.2.1.2 构建RAC1shRNA慢病毒载体 将pLKO.1-puro慢病毒载体用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收7 kb处条带。将目的片段与胶回收产物用T4DNA连接酶连接，导入DH5α感受态细胞扩增后，涂布于氨苄抗性的琼脂板上，挑取单个菌落扩增并提取质粒。

1.2.1.3 慢病毒包装和感染靶细胞 将RAC1shRNA慢病毒载体和辅助质粒(psPAX2和pMD2.G)共转染对数生长期的HEK-293T细胞，转染后48 h和72 h收集上清液，通过0.45 μm滤菌器，-80 ℃保存备用。当OVCAR3和SKOV3细胞密度达到40%时，将病毒液和培养基等比例混合并添加8 mg/L聚凝胺增强病毒感染力，反复感染细胞2次后利用嘌呤霉素筛选获得稳定敲减RAC1的卵巢癌细胞株。

1.2.2 蛋白质印迹检测RAC1敲减后卵巢癌细胞的RAC1和TJP1蛋白表达 细胞用RIPA裂解后提取总蛋白，蛋白经70 V SDS-PAGE电泳2 h、350 mA转膜90 min和5% BSA封闭1 h后，按1 ∶1 000的比例用封闭液稀释GAPDH、RAC1、TJP1抗体，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后孵育对应的二抗(TBST稀释，1 ∶10 000)，采用ECL化学发光自显影，利用Image J软件将目的条带灰度数值化，并与内参的灰度值作归一化处理，制作直方图。

1.2.3 划痕实验观察RAC1敲减后卵巢癌细胞的迁移能力 将对数生长期的卵巢癌细胞接种于6孔板中，细胞密度达95%时，用Tip头垂直于6孔板划痕，PBS轻轻洗涤2次后加入无血清DMEM继续培养，0 h和24 h后在倒置显微镜下对划痕进行拍照。计算公式为：细胞相对迁移率=[实验组(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/对照组(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)]×100%。

1.2.4 基质胶侵袭实验观察RAC1敲减后卵巢癌细胞的侵袭能力 按照3 ∶100的比例混合基质胶和DMEM，将100 μL混合液滴入小室中央，放置细胞培养箱中3 h。下室加入800 μL完全培养基，上室加入200 μL含(4～8)×104个对数生长期卵巢癌细胞的DMEM。培养24 h后取出小室，PBS洗涤2次，甲醇固定30 min，PBS洗涤2次。用棉球轻轻拭去小室上层细胞，结晶紫染色15 min，PBS洗涤2次，吹干后显微镜观察并拍照。

1.2.5 免疫荧光染色观察RAC1敲减后卵巢癌细胞TJP1蛋白的分布 将对数生长期的卵巢癌细胞接种于细胞玻片，细胞密度达50%时用4%多聚甲醛固定，PBS洗3次。0.5% Triton-X破膜，PBS洗3次。5% BSA封闭1 h，TJP1抗体孵育过夜。次日，PBS洗涤后孵育荧光二抗1 h，PBS洗3次。DAPI染核5 min，PBS洗3次。取出爬片倒置于滴加抗荧光淬灭剂的载玻片上，透明甲油封片，利用共聚焦荧光显微成像系统拍照。

1.3 统计学分析

所有实验均重复3次，应用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析和作图。两组独立样本间的比较，如数据服从正态分布则使用t检验，如不服从正态分布则使用非参数t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建pLKO.1-puro RAC1 shRNA载体

构建的RAC1shRNA载体转化后，随机挑取6个菌落扩增后提取质粒进行酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳显示第1、5和6号样本酶切产物条带位置正确(约5 000 bp和2 000 bp)，见图1A。选取1号样本测序发现载体中插入的序列与合成的RAC1shRNA序列一致，见图1B，说明成功构建pLKO.1-puroRAC1shRNA载体。

A：RAC1 shRNA载体酶切电泳图，M：DNA标准参照物，1～6：6个菌落分别对应的质粒样本；B：RAC1 shRNA载体中插入序列测序结果

2.2 慢病毒感染后卵巢癌细胞中RAC1蛋白表达下降

蛋白质印迹结果显示，与空载对照组相比，感染RAC1shRNA慢病毒的OVCAR3和SKOV3细胞中RAC1蛋白表达水平明显下降(t值分别为8.37和8.90，P<0.05)，见图2。证明RAC1shRNA慢病毒感染的OVCAR3和SKOV3细胞成功敲减RAC1基因。

2.3 稳定敲减RAC1基因后卵巢癌细胞迁移能力降低

细胞划痕实验显示，稳定敲减RAC1的OVCAR3和SKOV3细胞迁移能力较空载对照组明显降低(t值分别为40.17和41.76，P<0.01)，见图3。说明稳定敲减RAC1基因能显著抑制卵巢癌细胞的迁移能力。

2.4 稳定敲减RAC1基因后卵巢癌细胞侵袭能力下降

基质胶侵袭实验显示，与空载对照组相比，稳定敲减RAC1的OVCAR3和SKOV3细胞在24 h内穿过基质胶的细胞数量明显减少(t值分别为17.06和8.50，P<0.01)，见图4。说明稳定敲减RAC1基因能抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。

2.5 稳定敲减RAC1基因后卵巢癌细胞中TJP1蛋白的表达和分布

蛋白质印迹结果显示，稳定敲减RAC1的OVCAR3和SKOV3细胞中TJP1蛋白表达量较空载对照组无显著差异(P>0.05)，见图5。说明RAC1不影响卵巢癌细胞中TJP1的表达。

免疫荧光染色发现，空载对照组OVCAR3和SKOV3细胞中TJP1蛋白主要分布在细胞质，而细胞间较少。稳定敲减RAC1后细胞形态明显变小，TJP1蛋白由胞质迁移至胞膜附近，集中在细胞间接触处，排列呈致密的毛刺样，细胞间连接更加紧密，见图6。结果表明，卵巢癌细胞中稳定敲减RAC1并不影响TJP1蛋白的表达，但可调节TJP1蛋白在细胞中的分布，使细胞间紧密连接加强。

a：P<0.05，与对照组比较

标尺为200 μm；a：P<0.01，与对照组比较

标尺为200 μm；a：P<0.01，与对照组比较

3 讨论

随着手术、放化疗、分子靶向药物和肿瘤免疫治疗的不断发展，许多肿瘤患者的生存时间都得到了不同程度的延长，但卵巢癌患者5年生存率仍低于40%，主要原因之一是卵巢癌极易在腹腔中播散转移[7]，而恶性肿瘤难以治愈的根本原因就是肿瘤的侵袭转移。作为小GTP结合蛋白的Ras超家族成员，RAC1能调控细胞生长、骨架重组和激活蛋白激酶。RAC1可激活WASP家族富含脯氨酸同源蛋白(WAVE)调控复合物和蛋白激酶A，加快肌动蛋白聚合和板状伪足的形成，从而促进细胞迁移和侵袭[8-9]。Fang等[10]发现RAC1能激活MEK1/2和Src信号通路使卵巢癌细胞获得间质表型，促进细胞的迁移和侵袭特性。RAC1还可通过ROS/MAPK/AP-1和PAK/p38/MMP-2信号轴抑制卵巢癌细胞中基质金属蛋白酶的产生，促进细胞外基质的重塑和降解，建立和维持钙黏蛋白和连环蛋白介导的上皮细胞间黏附[11-12]。本研究结果表明稳定敲减RAC1能显著抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，说明RAC1是参与调控卵巢癌转移的重要分子。

图5 蛋白质印迹检测RAC1敲减后卵巢癌细胞TJP1蛋白表达

箭头标注为TJP1集中分布的位置，标尺为25 μm

TJP1作为调控细胞紧密连接的关键因子，具有连接细胞间屏障和调节肌动蛋白的作用。TJP1可以增强细胞间连接，抑制肿瘤细胞从原发部位解离，减少对周围组织的侵袭和转移[13]。乳腺癌、结直肠癌和肝细胞癌中TJP1表达下调，会促进肿瘤细胞的增殖和侵袭[14-16]。因此，TJP1与肿瘤细胞的迁移和侵袭特性密切相关。此外，我们的前期研究也发现TJP1与卵巢癌细胞迁移侵袭的抑制密切相关[17]，但其调控机制尚未阐明，因此我们试图探讨RAC1是否通过TJP1调控卵巢癌细胞的迁移和侵袭。结果发现稳定敲减RAC1的卵巢癌细胞中TJP1蛋白表达并未上调，但是免疫荧光染色显示TJP1的分布由胞质转移至胞膜，在细胞间连接处显著聚集，导致卵巢癌细胞与细胞间TJP1表达相对增加，并伴随着细胞间紧密连接加强和细胞体积缩小，这些变化都会降低细胞的迁移和侵袭能力。因此，我们推测RAC1可能是通过调节卵巢癌细胞中TJP1蛋白的分布从而调控肿瘤细胞的转移潜能。一些研究报道也佐证了这一结果，Knezevic等[18]用血小板活化因子刺激HUVEC细胞后，GTP-RAC1被激活，全细胞裂解液中TJP1表达量未发生改变，但是TJP1在近胞膜处的闭合带状结构出现断裂甚至消失。Kleeff等[19]报道TJP1在细胞膜上的分布与细胞的迁移和侵袭能力相关。1-磷酸鞘氨醇可依赖于皮层蛋白(cortactin)将TJP1转运至片状伪足，调节细胞的趋化、迁移和扩散[6]。这些调控为TJP1从胞质转移至胞膜提供了可能。

综上所述，本研究结果表明卵巢癌细胞中稳定敲减RAC1可能通过影响TJP1蛋白的细胞内分布，增强细胞间紧密连接，从而抑制细胞迁移和侵袭。这为探寻卵巢癌转移的调控机制和寻找抑制转移的分子靶点提供了实验依据，但RAC1调控TJP1分布的具体机制有待于进一步研究。