不同CD8+T细胞分化状态对CAR-T实体肿瘤疗效影响的研究进展

田圩虹，吕巧怡，刘雪，赵杨静,2，王荟,2，邵启祥,2

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏省检验医学重点实验室，江苏 镇江 212013)

肿瘤免疫疗法的革命性胜利将人们对各种免疫细胞及免疫分子的认识推上了新的高度。荣获2018年诺贝尔生理或医学奖的免疫检查点阻断疗法揭示了负性免疫调节分子细胞程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)在肿瘤治疗中的重要作用。与免疫检查点阻断疗法在临床获得巨大成功一样，嵌合型抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)疗法也在临床取得了惊人的疗效。这种过继性免疫增强化疗法通过基因编辑的患者T细胞直接靶向抗原特异性肿瘤细胞，目前主要应用于B细胞系急性白血病和淋巴瘤的治疗。CTL019也因治疗CD19+淋巴瘤获得很高的临床缓解率而成为CAR-T疗法的典型代表[1]。

截至目前，关于CAR-T细胞在恶性血液系统肿瘤，乃至实体肿瘤上的研究如火如荼。相较于血液系统肿瘤的治疗，CAR-T在实体肿瘤应用方面面临着许多挑战。实体肿瘤抗原表型异质性大，纤维胶原包裹致密，肿瘤微环境更为复杂，因此，在CAR-T治疗中通常选用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的CD8+T细胞作为特异性细胞毒作用的主力群体。通过CAR修饰的CD8+T细胞识别抗原的方式类似于B细胞，不需要抗原提呈过程，且不受自身主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC) 限制，在活化后可快速攻击杀伤肿瘤细胞。然而CD8+CAR-T用于实体瘤治疗时出现体内耗竭过度现象，细胞发生明显的凋亡，且效率较差。

研究表明处于分化终末期的成熟CD8+T细胞在过继输注后，在体内除了出现复制性衰老和过早凋亡现象外，在淋巴归巢循环、共刺激能力以及稳态细胞因子释放与获取方面都明显减弱[2]。而基于这些细胞构建的CD8+CAR-T却在体外具有显著的细胞毒效应，因此，体外的细胞毒作用效果并不能很好地反映其在体内的肿瘤杀伤能力，这是目前CD8+CAR-T实体瘤治疗亟待研究的重要问题。

1 CD8+CAR-T的制备与治疗实体肿瘤的现状

1.1 CD8+CAR-T的制备

CAR-T生产中T细胞群体的选择和质量控制对CAR-T过继免疫疗效起着决定性作用[3]。根据迄今为止完成的多项CAR-T临床研究，不同CAR-T研究中选择的T细胞亚群都存在显著差异，但直接关于不同CAR-T产品的横向对比研究鲜见报道。绝大多数针对肿瘤临床治疗的CAR-T不选择绝对单一化T细胞亚群作为CAR修饰T细胞的来源，而是通过分离患者来源的外周血单个核细胞(PBMCs)或CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)来进行体外扩增诱导，再经基因编辑后使用[4]。部分研究性实验选用分离自小鼠脾脏来源的淋巴细胞，经CD3/CD28抗体、IL-2及IL-7诱导T淋巴细胞增殖分化，以此制备相关CAR-T细胞在动物体内研究抗肿瘤作用。CD8+T细胞是机体进行免疫防御与监视的主要细胞，具有识别并杀伤恶性肿瘤和癌前病变细胞的能力。分离并采用患者自体来源的CD8+T细胞在乳腺癌、肝癌、神经母细胞瘤和黑色素瘤等癌症的CAR-T治疗中已有大量报道，是目前最常用制备CD8+CAR-T的T细胞群体[5]。

体外基因编辑的CD8+CAR-T表达肿瘤特异性CAR和T细胞受体，经过大量扩增活化后再回输到患者体内进行免疫治疗。CAR是靶向特定肿瘤抗原的重组受体，也是CAR-T细胞行使抗肿瘤杀伤作用的关键分子，其设计包含4个组分： ① 针对靶抗原的特异性单克隆抗体单链可变区(scFv)；② 跨膜区；③ 胞内共刺激信号结构域(CD27、CD28、4-1BB、OX40等)；④ T细胞受体活化信号转导区(CD3ζ等)。到目前为止，CAR已有三代。第一代CAR包括单链抗体、跨膜区和CD3ζ胞内区，但不包含共刺激信号活化转导结构域；二代CAR在一代的基础上加入了一个共刺激信号活化转导结构域；三代CAR改善了共刺激分子，采用了双共刺激信号活化转导结构域组合(比如CD28联合4-1BB或OX40等)，实现了对T细胞活化和增殖能力的优化。目前在临床使用的CAR-T以二代CAR为主体。在三代CAR之后，CAR-T制备更加注重体内T细胞功能的优化，比如在CAR-T细胞中共表达各类细胞因子或功能分子来增强CAR-T在体内的增殖存活能力、细胞毒作用或拮抗肿瘤微环境的能力，如使用IL-7、IL-12、CCL19、TGF-β抗体、PD-1抗体等进行共表达，有人也把这类CAR-T称为第四代CAR-T。因此，与传统的放化疗相比较，CD8+CAR-T细胞疗法具有更高的特异性、潜在的长期保护效应及更低的细胞毒性。

1.2 CD8+CAR-T的实体肿瘤治疗现状

根据宾夕法尼亚大学June教授2018年报告的全美1 000多例临床CAR-T治疗案例分析[6]，CAR-T疗法针对成人急性B淋巴细胞白血病的初期缓解率高达93%。针对慢性淋巴细胞白血病，大B细胞淋巴瘤及滤泡性淋巴瘤患者的有效率在70%左右。而在实体肿瘤的治疗中，CD8+CAR-T针对胰腺癌治疗缓解率为17%，其中1例胰腺癌伴肝转移的病例完全治愈了肝脏转移灶，但对原位癌的清除没有起到任何效果。另1例靶向神经胶质母细胞瘤的CAR-T临床试验，临床效果维持了7.5个月后患者复发。这份报告指出CAR-T针对实体肿瘤的治疗尚有一定的缓解效率，其在输注初期的靶向杀伤效力明显，起到了显著缓解肿瘤症状的作用。然而CD8+CAR-T在相当长的一段时间内却无法完全清除肿瘤细胞，说明这些临床试验所采用的CAR-T不具备长久免疫监视、清除肿瘤细胞的能力。因此，针对实体瘤的完全清除，需要CAR-T长期有效的体内增殖以及源源不断地自我更新补充。因此，具备自我更新能力的记忆性CAR-T是取得抗实体瘤持久战胜利的重要保障[7]。

纵观我国近年来发布的近50项CAR-T抗实体瘤临床试验，其中包括针对间皮素的抗胰腺癌CAR-T，针对磷脂酰肌醇聚糖-3(glypican-3，GPC3)的抗肝细胞癌CAR-T，针对上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗前列腺癌CAR-T，针对EB病毒潜伏膜蛋白-1(Epstein-Barr virus latent membrane protein-1，LMP1)的抗鼻咽癌CAR-T，针对血管内皮细胞生长因子受体-1(vascular endothelial growth factor receptor-1，vEGFR-1)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)的抗乳腺癌、宫颈癌和神经母细胞瘤CAR-T等产品，虽在实验室取得了良好的体外抗肿瘤疗效，但至今均未能取得振奋人心的临床数据[8-9]。Ma等[10]在总结2019年中国CAR-T临床实体瘤试验情况时指出，高度致密的实体肿瘤组织内部pH值低、缺氧、营养耗竭且具有复杂的抑制性肿瘤微环境，使得CAR-T细胞无法充分趋化、浸润到肿瘤局部，并扩增到有效数量发挥抗瘤作用，这些因素导致了CAR-T针对实体瘤的不良疗效。因此，成功的CAR-T方案不仅需要针对肿瘤抗原高度特异的CAR，同时也需要能在体外诱导扩增出具有良好抗肿瘤效应的CAR-T群体，以确保其在体内的稳定增殖，充分发挥体内抗肿瘤作用，减少CAR-T在体内出现自我增殖衰退、细胞衰老和凋亡，以及因肿瘤内环境引起的损耗。

2 CD8+T细胞的再分化亚群及功能研究对CAR-T亚群筛选的意义

2.1 CD8+T细胞的再分化

CD8+T细胞的分化过程在感染免疫学中研究得比较清楚，其活化后可分化为效应细胞和记忆细胞，早期根据IL-7Rα和杀伤细胞凝集素样受体G1(killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1)等细胞表面标志将活化后的CD8+T分为KLRG1lowIL-7Rhigh的记忆前体效应细胞(memory precursor effector cells，MPECs)和KLRG1highIL-7Rlow的短期效应T细胞(short-lived effector cells，SLEC或terminal effector cells，TEFF)[11]。MPECs可进一步分化，根据CD62L、CCR7等表型分子又分为干细胞样记忆型T细胞(stem cell like memory T cell，TSCM)、中枢型记忆T细胞(central memory T cell，TCM)和效应记忆T细胞(effector memory T cell，TEM)[12]，TCM和TEM都属于长寿命记忆T细胞(long-lived memory T cell)。TEFF具有强细胞毒作用，大量表达FasL，分泌肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、穿孔素(perforin)、颗粒酶B(gramzyme B)等众多细胞毒性分子应对机体细胞的感染或病变。但另一方面，TEFF作为CD8+T细胞活化后的高效靶向杀伤细胞群体，增殖潜力受损，PD-1、LAG3等免疫负向共刺激分子的表达显著上调[13-14]，在机体免疫自稳的调节机制作用下迅速凋亡。这也是抗原和炎症持续存在时TEFF耗竭的重要原因。不同分化亚群的CD8+T细胞在增殖潜力，迁移归巢能力，IL-2分泌水平，效应功能以及细胞毒性方面均显示出了较大差异(图1)。

Naive T：初始T细胞；-：不表达；+：低表达；++：中度表达；+++：高表达

CD8+记忆T细胞分化亚群的多样性归因于初次免疫和记忆应答所接受的不同抗原和炎症环境刺激的累积。靶抗原的类型、抗原刺激持续的时间及炎症信号的强弱都会影响CD8+T细胞的效应功能以及再次免疫应答反应。由图1可知，初始CD8+T细胞随着接受刺激信号质量与强度的积累，启动增殖并逐渐沿着 TSCM→TCM→TEM→TEFF分化轴进行分化，该过程伴随着趋化因子CCR7、淋巴归巢分子CD62L以及共刺激分子CD27/CD28的逐渐下调。随着细胞接收到的信号强度逐渐增大，初始T细胞最终分化为短寿命的TEFF细胞。TEFF具有高水平IFN-γ分泌能力和极强的细胞毒作用，但处于分化的终末状态，KLRG1、CD95分子表达上调，自我更新能力丧失，衰老性复制明显，端粒长度缩短，凋亡显著，已是“强弩之末”。

2.2 基于分化早期CD8+T制备CAR-T的优势

2.2.1 分化早期CD8+T细胞显著高表达淋巴归巢分子与共刺激分子 Gattinoni教授团队的多种体内外实验证实分化早期的T细胞不仅在体外具有很好的靶向肿瘤杀伤作用，同时也能在体内更有效地清除实体瘤；而分化程度较高的晚期T细胞在体内的治疗效果则较差[15]。分析活化早期与晚期T细胞的基因差异表达与表面分子标志，可见分化早期的T淋巴细胞显著高表达淋巴归巢分子(如CD62L、CCR7)[16]和共刺激分子(如CD27、CD28)。高表达的共刺激分子预示着早期CD8+T细胞强大的分化和活化潜能，而高表达的CD62L、CCR7等淋巴归巢分子可促使活化早期T细胞制备的CAR-T在体内输注后具有更高的淋巴组织归巢能力[17]。通过归巢至肿瘤抗原刺激的淋巴结能够更有效增加CAR-T与专职APCs接触的机会，更好地诱导CAR-T细胞靶向肿瘤抗原，活化并发挥杀伤肿瘤的功能。虽然在肿瘤免疫原性极强的情况下CAR-T细胞归巢至淋巴结的必要性不大，但对于大多数肿瘤，其抗原性均较弱，因此要彻底清除和预防肿瘤复发，淋巴归巢循环的过程就非常重要，可加强机体免疫系统对肿瘤的免疫监视[18]。利用终末分化的TEFF制备CAR-T，在输注后的短期内其直接抗肿瘤活性也许很强，且部分实验研究也表明CD62低表达的T细胞亚群比初始T细胞具有更好的抗肿瘤活性，但缺乏持久的抗肿瘤效应和免疫记忆性。因此，过度关注于研究分化终末期CD8+T细胞制备CAR-T的抗肿瘤性能，而忽视利用分化早期具有自我更新、免疫记忆和强大增殖潜力等特征的T细胞制备CAR-T，可能是当前多数CAR-T临床实体瘤治疗存在的误区之一。

2.2.2 细胞因子的稳定获取是分化早期T细胞维持增殖和存活的重要条件 分化进程中的T细胞常常会因为缺少稳定的细胞因子支持而无法正常增殖和存活，最终丧失抗肿瘤活性。IL-2是重要的淋巴细胞活性调节因子，无论是体外扩增肿瘤特异性的CD8+T细胞，还是体内过继输入CD8+CAR-T治疗时都应给予一定水平的IL-2维持细胞增殖，撤去IL-2则会直接导致T细胞的凋亡[19]。在不同阶段的T细胞分化模型中，只有分化早期的CD8+T细胞能通过自分泌的方式自给自足高水平的IL-2。幼稚期的T细胞需要进一步的抗原诱导分化才能获得这种能力，而中晚期的CD8+T细胞则更多需要在Th1细胞的帮助下获得IL-2。因此，能够稳定维持自身IL-2分泌水平、保障了自我增殖能力的早期CD8+T细胞，初步具备了构建高效率CD8+CAR-T的良好特征属性。

IL-7和IL-15作为IL-2同家族的细胞因子，是T淋巴细胞增殖、活化及维持分化的重要分子，对CD8+记忆T细胞的生成与存活尤为关键。IL-7Rα亚基(CD127)是分化早期T细胞转化为长寿命的记忆T细胞的标志之一[20]，且中晚期的T细胞表达低水平IL-7Rα不利于其自身的生存。日本学者制备的“7×19”CAR-T就是基于这一原理[21]，将IL-7和CCL19分子联合CAR共表达，通过增加局部的IL-7和CCL19水平，赋予CD8+CAR-T细胞额外的增殖能力和趋化能力，帮助其提升实体瘤杀伤效率，增强体内抗瘤能力，获得了较为理想的效果。IL-15对维持记忆T细胞的免疫应答有重要作用，并在免疫应答结束时通常会促进CD8+TCM的生成[22]。IL-15对过继转移的CD8+CAR-T的生存和分化具有支持作用，常应用于体内外CAR-T细胞增殖和效应功能的维持，显著提高了过继CAR-T的抗肿瘤疗效[23-24]。

IL-21能与IL-7和IL-15产生强烈的协同效应，共同调控CD8+T细胞的增殖。此外，IL-21还可以抑制由IL-15引起的初始CD8+T细胞CD28、CD62L分子的下调，使其继续发挥共刺激和淋巴归巢的能力[25]。Moroz等[26]在早年就揭示了IL-21潜在的抗肿瘤性能，对比IL-2与IL-15，小鼠腹腔注射IL-21不仅不良反应极小，还有效地加倍了50%胸腺瘤小鼠的生存时间。更进一步的研究指出，IL-21治疗使荷瘤小鼠生存率提高归因于CD8+CD27highCD28highCD45RO+记忆型T细胞的产生[27]。尽管IL-21对记忆型T细胞产生的作用机制还未完全阐明，但其促进CD8+CAR-T杀伤肿瘤并诱导生成记忆型CAR-T已获得不少体内外实验的证实[28-30]。

2.3 分化晚期CD8+T细胞抗肿瘤效应处于明显劣势

复制性衰老是包括T细胞在内的所有体细胞的必经末路，高表达KLRG-1的效应型记忆CD8+T细胞增殖潜力受限[31]，从TEM到TEFF，细胞的复制能力持续降低，进入不可逆的复制性衰老期。尽管分化晚期的CD8+T细胞是肿瘤高度反应性的T细胞，但是这些T细胞已经耗尽了增殖和存活能力，过继移植这群终末分化期CD8+T细胞制备的CAR-T，在体内凋亡过度，显然不利于实体肿瘤的治疗。T细胞活化诱导的细胞凋亡(AICD)是维持机体免疫稳态、防止自身免疫性疾病发生的重要机制，高度分化的CD8+T细胞大量表达CD95/Fas，Fas-FasL介导的凋亡途径活化明显。与此同时，促凋亡的BH3结构域凋亡诱导蛋白BID、BAD也在这群CD8+T细胞中过度表达[15]。除此之外，肿瘤微环境中的免疫抑制分子PD-1/PDL1/CTLA-4是导致该类细胞制备的CAR-T在实体肿瘤中发生耗竭的重要因素[32]，通过加入抗4-1BB的抗体以及对PDL1和CTLA-4负性调控分子进行中和，抑制CD8+T细胞的过度活化，阻止细胞的终末分化进程，有效减少了CD8+TILs的凋亡，促进其在肿瘤局部的有效积聚，提高了CD8+TILs抗实体肿瘤的能力[33]。

抑制性的肿瘤微环境是CAR-T实体瘤疗法亟待解决的重大问题。相对于血液系统肿瘤较弱的免疫信号抑制，实体瘤通常被多种类型的促瘤细胞浸润，如支持肿瘤生长的脉管系统，M2型巨噬细胞(TAMs)，调节性T细胞和骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)等。除此以外，免疫检查点的抑制信号及肿瘤组织异常表达的TGF-β，都是阻遏CAR-T细胞向肿瘤组织浸润的重要因素[34]。处于分化晚期的TEFF细胞，仅具有短期介导肿瘤溶解与破坏的能力，无法长期在抑制性的肿瘤微环境中持续杀伤肿瘤细胞，尤其还要面对恶性肿瘤中多能癌症干细胞的长期克隆增殖。而处于分化早期的CD8+T细胞群体，包含了更多的TSCM与TCM，不仅能通过活跃的分化产生更多的高细胞毒性TEM和TEFF来维持长时间的免疫攻击，还能同时维持低分化TSCM和TCM的持续供应，不断刷新细胞毒性效应T细胞的储存池[35-37]。这种长效维持的杀伤方式，可能使具有自我更新、增殖存活和再活化能力的早期T细胞最终清除所有的肿瘤细胞，包括多能癌症干细胞，从而达到治愈实体瘤的可能。

3 干细胞样记忆型CAR-T的发展

随着CAR编辑技术的蓬勃发展，利用基因工程将多能干细胞诱导构建CAR-T也取得了长足进步。通过编辑干细胞样的T细胞亚群制备CAR-T能有效克服目前过继免疫治疗可能出现的无效增殖、体内生存期短和不能介导长效免疫应答的缺陷[38-39]。Xu等[40]在14名接受CD19-CAR-T治疗的B细胞恶性肿瘤患者中研究发现，CAR-T群体中表现为CD8+CD45RA+CCR7+的特殊亚群显著促进过继T细胞在体内的抗肿瘤疗效，这群细胞的数量是体内CAR-T持续增殖的唯一关键，也是持久抗肿瘤的重要保证。这一特殊的细胞群体符合记忆性T细胞的特征，并在IL-7和IL-15的支持下具有更优良的抗肿瘤特性。过继输入具有干细胞特征的CAR-T进行肿瘤免疫治疗，可诱导产生记忆性T细胞并长期存活。这一现象在其他血液系统肿瘤的治疗中也得到印证[41]。相对于同时期的标准CD19-CAR-T治疗组，在急性B淋巴细胞性白血病的NSG模型小鼠中，使用具有干细胞特性的记忆T细胞制备的CAR-T治疗，可产生100%的缓解效率[29]。

利用干细胞样记忆型T细胞制备的CAR-T在血液肿瘤患者体内具有持久的疗效，促使研究者尝试将具有干细胞性质的T淋巴细胞应用于CAR-T实体肿瘤治疗。从CD8+T干细胞潜能的Waddington模型可以看出[42]，类干细胞的功能属性和信号通路在T淋巴细胞的发育分化成熟的各个亚群中具有共享性，即终末分化阶段前的各淋巴T细胞亚群均具有分化为记忆T细胞的能力。初始T淋巴细胞通过渐进分化持续过渡为终末效应T细胞，在此分化过程中虽然其干细胞特征逐步弱化，但这些阶段产生的各种记忆型T细胞都维持有一定的干细胞特征，是维持人体免疫的中坚力量。因此，在CD8+CAR-T实体瘤治疗方面，除终末效应T细胞之外，各阶段的记忆淋巴细胞亚群都可能是CAR-T很好的来源，但尚需要大量的研究证实和优化。

4 小结与展望

目前用于制作CD8+CAR-T进行过继免疫治疗的方法基本都属于20多年前开发策略的延续，当时T细胞分化对体内抗肿瘤疗效的影响尚未得到充分认知。这些诱导方法过度注重对T细胞强有力的体外活化刺激，包括使用CD3单克隆抗体、高浓度的IL-2和高特异性抗原肽致敏，从而获得了大量肿瘤反应性CAR-T，虽然其在体外可分泌高水平IFN-γ，储备了大量的穿孔素和颗粒酶，对靶肿瘤细胞具有非常强大的直接杀伤能力，但不可避免地推动了T细胞走向终末分化，进入衰老的进程。终末分化的TEFF丧失多种功能，表现为① 淋巴归巢和共刺激分子表达下调；② 不能分泌大量的IL-2和稳定获得细胞因子； ③ 进入凋亡和复制性衰老状态； ④ PD-1/LAG3/CTLA-4等负性分子表达上调。而分化早期的CD8+T细胞干细胞样标志明显，自我更新能力强、具有持续的分化能力和免疫记忆功能。包括TSCM、TCM在内的早期记忆型T细胞表达高水平的共刺激分子和归巢受体，具有稳定的细胞因子自分泌与摄取能力，可以在肿瘤局部进行良好的自我更新与补充。因此，对不同CD8+T分化状态、功能特性进行比较与总结，免疫过继疗法中CD8+T淋巴细胞的选择应该涵盖对其4个基本方面的考察： ① 体外肿瘤杀伤效力；② 体内活化能力； ③ 增殖能力； ④ 存活能力和免疫记忆能力。这4个方面的T细胞评估对CAR-T实体肿瘤治疗具有重要意义。