蛋白质精氨酸甲基转移酶5促进人卵巢癌HO8910细胞迁移

赵康容，孙爱琴，林琼，邵根宝

(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1]，尽管早期诊断可以提高生存率，但仅有约15%患者能在早期获得诊断[2]，绝大部分患者就诊时就已经处于晚期阶段。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)能够特异性催化组蛋白及非组蛋白等底物的对称性甲基化[3]，从而影响多个靶基因及多条信号通路，发挥众多生物学功能[4-5]。研究表明，PRMT5在多种恶性肿瘤如淋巴瘤[6]、胶质瘤[7]、乳腺癌[8]和白血病[9]等中呈高表达，且其高表达与肿瘤恶化及患者预后相关。我们前期研究发现，上调PRMT5表达可以促进卵巢癌细胞生长和增殖[10]。然而，PRMT5对卵巢癌细胞功能影响的具体机制仍不清楚。因此，本研究旨在探讨PRMT5表达与卵巢癌细胞上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)之间的关系及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人卵巢癌HO8910细胞株为本实验室长期保存；多西环素(doxycycline，Dox)诱导型稳定敲低PRMT5的HO8910细胞株用pLKO-Tet-puro慢病毒诱导型载体构建，构建方法参考文献[11]。

1.1.2 主要试剂和仪器 骨架载体pLKO-Tet-On、pHR-CMV-8.2ΔVPR、pHR-CMV-VSVG以及pLKO-Tet-On-SC、pLKO-Tet-On-PRMT5、pCMV-Myc、pCMV- Myc-PRMT5质粒由美国普渡大学胡长灯教授惠赠。兔抗人PRMT5多克隆抗体，兔抗人α-微管蛋白单克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG抗体购自美国 Bioworld 公司；基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、波形蛋白、N-钙黏蛋白和E-钙黏蛋白抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；聚凝胺、Dox和嘌呤霉素(美国 Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000试剂(美国 Invitrogen公司)；荧光定量PCR试剂盒，RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(日本 TaKaRa 公司)；PVDF膜和ECL显影试剂(美国Millipore公司)。

核酸测定仪Biomate 3s(美国Thermo Scientific公司)；Mx3000p Real Time PCR扩增仪(美国Stratagene公司)；Alpha化学发光凝胶成像系统Fluor Chem FC3(美国Protein Simple公司)；倒置显微镜BX51(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H08910细胞株培养于含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素混合液的DMEM中，37 ℃、5%CO2培养，常规传代。

1.2.2 PRMT5 shRNA干扰质粒构建 pLKO-PRMT5-shRNA质粒和对照质粒pLKO-Tet-On-SC的构建参照文献[12]。PRMT5-shRNA引物序列：上游5′-GCCCAGTTTGAGATGCCTTAT-3′，下游5′-CCCATCCTCTTCCCTATTAAG-3′。

1.2.3 HO8910细胞株中敲低PRMT5的效率验证 实验分为pLKO对照组(感染空载体慢病毒)、pLKO+Dox(100 ng/mL)组、shPRMT5组(感染PRMT5 shRNA 慢病毒)和shPRMT5+Dox(100 ng/mL)组；将处于对数生长期的HO8910细胞接种于6 cm培养皿，孵育12～24 h；换液加入3 mL DMEM和1 mL病毒液(2.0 μg pLKO-Tet-On-SC、2.0 μg pLKO-Tet-On-PRMT5)，混匀后加入8 μg/mL 聚凝胺感染细胞，孵育24 h；再重复上述步骤1次；用2.0 μg/mL 嘌呤霉素筛选72 h；再用含1.0 μg/mL嘌呤霉素培养基维持培养，直至筛选出稳定感染PRMT5- shRNA的HO8910细胞株(shPRMT5)；最后，用终质量浓度为100 ng/mL Dox诱导培养48 h；用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和免疫印迹法分别检测PRMT5 mRNA和蛋白表达水平。

1.2.4 HO8910细胞株中PRMT5过表达的效率验证 将处于对数生长期的HO8910细胞分为空白对照组(野生型HO8910细胞株)、阴性对照组(转染pCMV-Myc质粒)、实验组(转染pCMV-Myc-PRMT5质粒)，接种于6 cm培养皿，孵育12 h；将2.0 μg pCMV-Myc-vector(对照)和2.0 μg pCMV-Myc-PRMT5质粒用Lipofectamine2000转染HO8910细胞48 h；免疫印迹法用Myc检测各组Myc-PRMT5表达，qRT-PCR检测各组细胞PRMT5mRNA表达水平。

1.2.5 qRT-PCR法检测PRMT5 mRNA表达 取“1.2.3”和“1.2.4”分组细胞，按照RNA提取试剂盒操作手册提取细胞总RNA，并用紫外分光光度法测定RNA纯度和浓度。采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量试剂盒进一步行PCR扩增。PRMT5基因(NM_001282953.1)引物序列：上游5′-GTTTGAAGAATGGGGAAGCCAAGTG-3′，下游5′-GAGCCAGAAAGGAAGTGTACTCC-3′；以GAPDH基因(NM 001256799.1)为内参照，引物序列：上游5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。基因的相对表达量用2-ΔΔCt值表示。实验重复3次。

1.2.6 免疫印迹法检测PRMT5和EMT相关蛋白表达 收集稳定敲低和顺时转染过表达PRMT5的HO8910细胞，实验分为shPRMT5+Dox组(诱导感染PRMT5 shRNA 慢病毒)、shPRMT5组(未诱感染PRMT shRNA慢病毒)、PCMV-Myc组(未过表达PRMT5)和pCMV-Myc-PRMT5组(过表达PRMT5的HO8910细胞株)，用预冷PBS 洗2次；加入 200 μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液，置于冰上处理 20 min；以12 000 r/min，4 ℃离心15 min；取上清液即为总蛋白。各取50 ng总蛋白用分离胶浓度为8%～12%的SDS-PAGE分离蛋白(80 V电压30 min，110 V电压100 min)；转移至PVDF膜，300 mA恒流120～150 min；用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h；加入对应一抗E-钙黏蛋白、波形蛋白、N-钙黏蛋白和MMP2，均1∶500，α-微管蛋白单克隆抗体(1 ∶5 000)，4℃孵育过夜；次日，二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h；经ECL显影，用Image J软件定量。实验重复3次。

1.2.7 Transwell实验检测细胞迁移能力 按照参考文献[13]，实验分组同“1.2.6”，将细胞制备成不含血清的细胞悬液，每个Transwell小室上室接种1.5×105个HO8910细胞，下室加入500 μL含血清的DMEM，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h；用棉签擦拭膜上表面未迁移的细胞，迁移至下表面的细胞用4%多聚甲醛固定30 min；结晶紫染色液室温染色15 min；显微镜观察染色细胞。每个Transwell小室随机取5个视野，计数染色细胞，相对迁移率=转移细胞数/Transwell小室总细胞数。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 诱导型稳定敲低PRMT5的HO8910细胞株的效率验证

免疫印迹结果显示，与shPRMT5对照组比较，shPRMT5+Dox组HO8910细胞中PRMT5蛋白表达显著减少(t=4.927，P<0.05)；pLKO+Dox组PRMT5蛋白表达水平与pLKO对照组比较差异无统计学意义(t=1.208，P>0.05)。qRT-PCR结果同样显示，shPRMT5+Dox组PRMT5 mRNA表达较pLKO对照组、pLKO+Dox组、shPRMT5组显著减少(t=8.71，7.861，8.131，P均<0.01)。见图1。

2.2 PRMT5过表达效率验证

免疫印迹结果显示，空白对照组和阴性对照组均无标签蛋白Myc表达，而实验组检测到Myc表达。qRT-PCR结果显示，实验组PRMT5 mRNA表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(t=39.547，37.813，P均<0.01)。见图2。

2.3 PRMT5对卵巢癌HO8910细胞迁移的影响

Transwell结果显示，与shPRM5对照组比较，shPRMT5+Dox实验组中卵巢癌HO8910细胞迁移率显著减少(t=4.157，P<0.05)；pCMV-Myc-PRMT5组中HO8910细胞迁移率显著高于pCMV-Myc组(t=3.261，P<0.05)。见图3。

图1 免疫印迹和qRT-PCR验证HO8910细胞中PRMT5基因敲低的效率

图2 免疫印迹和qRT-PCR验证HO8910细胞中PRMT5基因过表达效率

图3 Transwell实验检测PRMT5过表达或敲低后细胞的迁移能力(结晶紫染色×200)

2.4 PRMT5敲低后EMT相关蛋白的表达

免疫印迹结果显示，与shPRMT5组相比，shPRMT5+Dox组HO8910细胞中PRMT5表达和间质标志分子MMP-2、波形蛋白和N-钙黏蛋白表达显著降低(P<0.01或<0.05)，而上皮标志分子E-钙黏蛋白表达显著增加(t=17.527，P<0.01)。见图4。

1:shPRMT5组，2：shPRMT5+Dox组；a：P<0.05，b：P<0.01，与shPRMT5组比较

2.5 PRMT5过表达后EMT相关蛋白的表达

免疫印迹结果显示，与pCMV-Myc组相比,pCMV-Myc-PRMT5组HO8910细胞中Myc表达、MMP-2、波形蛋白和N-钙黏蛋白表达显著升高(P<0.01或<0.05)，而E-钙黏蛋白表达显著降低(t=18.306，P<0.05)。见图5。

1:pCMV-Myc组；2:pCMV-Myc-PRMT5组；a：P<0.05，b：P<0.01，与pCMV-Myc组比较

3 讨论

EMT是上皮细胞转化为间质细胞的过程，它赋予细胞转移和入侵的能力，与肿瘤的发生发展进程相关[14]。EMT表现为细胞黏附能力丧失，E-钙黏蛋白表达下降，间质标志物和纤维连接蛋白表达上升，细胞运动能力和侵袭能力增强。研究报道[15]，PRMT5协同MEP50/WDR77复合物通过表观遗传调控作用诱导EMT进程，从而促进肺癌细胞侵袭和迁移。本研究采用卵巢癌HO8910细胞株，通过免疫印迹法和Transwell小室实验证实PRMT5促进卵巢癌细胞EMT进程，并增强细胞迁移能力。

细胞增殖与肿瘤发生发展密切相关，本课题组前期发现[10]，PRMT5对卵巢癌细胞的增殖有重要的调控作用，下调PRMT5可抑制HO8910细胞克隆形成，减低细胞DNA复制能力，并抑制细胞增殖；过表达PRMT5则相反，提示PRMT5可能作为一个潜在的致癌基因促进卵巢癌的发生发展。本研究发现下调PRMT5表达可以抑制卵巢癌HO8910细胞迁移，而过表达PRMT5则促进细胞迁移。

E-钙黏蛋白表达缺失或降低与肿瘤转移密切相关，在小鼠模型中证实E-钙黏蛋白缺失显著增强癌细胞侵入健康组织的能力[16]。本研究发现，敲低PRMT5可以促进上皮标志分子E-钙黏蛋白表达，而PRMT5过表达则反之，由此表明PRMT5与细胞迁移密切相关。此外，外源表达PRMT5后，间质标志分子MMP-2、波形蛋白和N-钙黏蛋白表达上调，并促进HO8910细胞迁移，提示PRMT5可能通过EMT依赖的方式调控卵巢癌细胞迁移。

综上，PRMT5在卵巢癌细胞迁移中发挥重要作用，其可促进卵巢癌细胞的 EMT进程及细胞迁移。然而，PRMT5对EMT转化过程的调控作用是否与表观遗传修饰有关，以及在体内卵巢肿瘤的转移中是否有相同的作用仍需进一步研究。