膀胱尿路上皮癌组织中SRSF1及Caspase-3的表达水平及临床意义

宰国真，王旭东，马梅，李彦伟

(郑州大学第五附属医院 病理科， 河南 郑州 450052)

选择性剪接为保持真核生物蛋白质功能多样性的重要途径，其在肿瘤的发生、发展中起重要作用[1]。丝氨酸/精氨酸富有剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1，SRSF1)为代表性选择性剪接因子，相关研究证实，其在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中存在过表达现象[2]。有研究指出，SRSF1可影响天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate specific proteinase，Caspase)、抗凋亡基因(Bcl-X)激活的DNA酶抑制蛋白的剪接，对肿瘤细胞的凋亡、生长起调控作用[3]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinecontaining aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)为重要细胞凋亡效应分子，可参与多种因素引起的细胞凋亡，其水平降低，可引起肿瘤细胞过度增殖。本研究探讨膀胱浸润性尿路上皮癌组织中SRSF1、Caspase-3的表达水平及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017年3月至2019年6月郑州大学第五附属医院收治的92个膀胱浸润性尿路上皮癌手术或活检标本为观察组，选取同期20个病理检查结果为正常膀胱尿路上皮组织的活检标本为对照组。对照组：男12例，女8例；年龄34～78岁，平均(51.26±8.52)岁。观察组：男56例，女36例；年龄35～76岁，平均(50.29±6.34)岁；肿瘤分级为53例高级别，39例低级别。所有病理切片由3名资深病理医生根据WHO(2004)泌尿系统和男性生殖器官肿瘤分类标准进行复诊。标本经100 g·L-1的中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋，做成厚4 μm的石蜡切片。两组性别、年龄、肿瘤分级比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究经郑州大学第五附属医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 免疫组织化学检测采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶方法(streptavidin peroxidase，SP)，按照免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)说明操作。兔抗人SRSF1多克隆抗体、兔抗人Caspase-3多克隆抗体均购自北京中山生物技术公司。采用梯度酒精、二甲苯对切片进行脱蜡水化，采用体积分数为3%的过氧化氢室温处理10 min，进行微波抗原修复，加入正常山羊血清室温孵育15 min，滴加稀释浓度为1∶200的一抗，在4 ℃保湿盒内孵育过夜。用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次3 min，滴加二抗，室温孵育10 min，滴加链亲和素显色10 min。采用苏木精复染，梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以磷酸缓冲盐溶液作阴性对照。

1.3 判断标准参考说明书观察SRSF1和Caspase-3蛋白的阳性表达情况，SRSF1主要定位于细胞核，Caspase-3主要定位于细胞质，细胞核或细胞质呈棕黄(褐)色判读为阳性。在高倍镜下进行细胞计数。染色强度打分：棕褐色为3分，棕黄色为2分，浅黄色为1分，无色为0分，并于背景着色对比。阳性细胞占比打分：阳性细胞>75%为4分，51%～75%为3分，11%～50%为2分，1%～10%为1分，阴性为0分。阳性细胞百分比乘以染色强度≥3分为阳性(+)。

1.4 观察指标(1)SRSF1表达及临床意义。(2)Caspase-3表达及临床意义。(3)SRSF1与Caspase-3表达相关性。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件处理数据。SRSF1、Caspase-3表达以频数和率(%)表示，组间比较采用χ2检验，采用Spearman对SRSF1、Caspase-3表达进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SRSF1表达观察组SRSF1阳性表达率[84.78%(78/92)]高于对照组[10.00%(2/20)]，差异有统计学意义(P<0.001)。观察组中单发与多发、低级别与高级别、转移与无转移及不同临床分期SRSF1阳性表达率比较，差异无统计学意义(均P>0.05)；复发性膀胱浸润性尿路上皮癌组织中SRSF1阳性表达率高于原发性癌，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 观察组SRSF1表达及临床意义[n(%)]

2.2 Caspase-3表达观察组Caspase-3阳性表达率[30.43%(28/92)]低于正常组[90.00%(18/20)]，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组中单发与多发、原发与复发、低级别与高级别、转移与无转移及不同临床分期Caspase-3阳性表达率比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 观察组Caspase-3表达及临床意义[n(%)]

2.3 SRSF1与Caspase-3表达相关性观察组78例SRSF1阳性表达中60例Caspase-3呈阴性表达，发生率为76.92%(60/78)，14例SRSF1阴性表达中10例Caspase-3呈阳性表达，发生率为71.43%(10/14)，两种蛋白表达均为阳性18例，均为阴性4例。以Spearman进行相关性分析，观察组Caspase-3与SRSF1的表达呈负相关(r=-0.369，P<0.05)。

3 讨论

膀胱癌为常见泌尿外科恶性肿瘤，近年来，其发病率、病死率呈上升趋势，严重威胁人类健康，且其发病机制尚未明确[4]。选择性剪接在肿瘤的发生、发展中起重要作用，SRSF1与肿瘤直接相关，相关研究证实，SRSF1调控可变剪接事件可促进肿瘤发生，同时可调控细胞侵袭、运动，与恶性肿瘤特点相同[5]。研究显示，SRSF1还通过调控Bcl-X和Caspase激活的DNA酶抑制蛋白的剪接对乳腺癌细胞生长及凋亡产生影响[6]。此外，肺癌中SRSF1可与抗凋亡蛋白Survivin mRNA结合，增强其稳定性，并促进其翻译，使其表达增加，同时抑制Caspase蛋白，抑制肺癌细胞凋亡[7]。细胞中Caspase蛋白家族通常以酶原(无活性)形式存在，但Caspase可自我活化、相互激活，呈级联放大效应参与凋亡过程，其中Caspase-3尤其重要，可破坏细胞核纤层，破坏细胞结构，参与多种因素引起的细胞凋亡[8]。

本研究以免疫组化法检测SRSF1、Caspase-3在膀胱浸润性尿路上皮癌与正常膀胱黏膜组织中的表达情况，结果显示，对照组SRSF1阳性表达率低于观察组，复发性膀胱浸润性尿路上皮癌中SRSF1阳性表达率高于原发性癌。这表明在膀胱浸润性尿路上皮癌中SRSF1高表达与肿瘤复发密切相关。观察组Caspase-3阳性表达率高于对照组，提示Caspase-3可能与肿瘤耐凋亡特征有关。研究发现，膀胱癌组织中Caspase-3低表达，且与膀胱癌复发密切相关[9]。本研究中Caspase-3蛋白表达降低与肿瘤复发、转移、病理分级、临床分期无相关性，有待进一步验证。此外，本研究相关性分析显示，观察组Caspase-3与SRSF1的表达呈负相关，提示SRSF1有抑制Caspase-3的作用，两者呈反向平衡。Caspase-3、SRSF1共同调节膀胱尿路上皮癌细胞凋亡，与其发生发展关系密切。

综上可知，SRSF1可能通过增加抗凋亡蛋白对Caspase-3起抑制作用，以抑制膀胱尿路上皮癌细胞凋亡。同时，SRSF1与膀胱浸润性尿路上皮癌的发生、发展及复发关系密切，膀胱浸润性尿路上皮癌组织中SRSF1高表达与Caspase-3低表达对膀胱尿路上皮癌患者病情进展起促进作用。