结核RNA检测在肺结核中的早期诊断价值

2020-09-22李成行李月翠张莉莉

浙江中西医结合杂志 2020年9期

李成行李月翠张莉莉

结核病的早期发现对于结核防控至关重要，然而部分患者临床表现及影像学表现不典型，诊断困难[1-2]。涂片及培养是肺结核传统的病原学检测方法，但阳性率均偏低，培养还存在时间过长的缺点[3]。结核RNA 检测的技术原理是以16S rRNA 为靶标，通过恒温RNA 扩增检测技术（SAT），快速准确地判断待检样本中是否有结核分枝杆菌的存在。结核RNA检测不仅扩增效率更高（30min 内扩增10 亿倍）、反应更稳定，还能够区分死菌活菌。且由于RNA 在环境中更容易降解，因此实验室污染更少[4-5]。本研究拟采用结核RNA 检测技术（TB SAT），对疑似结核病患者的痰液或支气管肺泡灌洗液标本进行测定，并对其结果进行分析比较，评估其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016 年1 月—2017 年6 月浙江省永康市第一人民医院收治的272 例肺部影像学异常的疑似结核患者，男151 例，女121 例。研究经医院伦理委员会审核通过，符合《赫尔辛基宣言》伦理原则，所有入组患者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准[6]（1）肺结核确诊标准：影像学具有疑似肺结核表现、涂片阳性，或分枝杆菌分离培养阳性，或肺组织病理学检查阳性的患者。（2）临床诊断肺结核的判断标准：胸部影像学显示与活动性肺结核相符的病变，具有咳嗽、咯痰、咯血等症状，免疫学检查阳性，经过诊断性抗结核治疗随访病灶好转或经鉴别诊断排除其他肺部疾病者。（3）非肺结核患者的判断标准：指诊断为肺结核以外的其他肺部疾病，且经过非结核病治疗好转者。

1.3 纳入及排除标准纳入标准：（1）患者存在明显的咳嗽、咳痰等临床变现；（2）符合活动性肺结核病变的胸部X 片表现。排除标准：既往有结核病的患者，不能耐受气管镜检查者。

1.4 仪器与试剂 TB SAT 采用的Mag-X 全自动核酸提取仪由中国嘉兴凯实生物科技有限公司提供、所用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪由美国ABI 公司提供、所用300W 水浴超声仪和RNA 恒温扩增试剂盒由中国上海仁度生物科技有限公司提供（批号20160201、20160501）；抗酸杆菌涂片染色液由珠海贝索生物技术有限公司提供（批号C150901）；全自动分枝杆菌培养鉴定药敏系统BACTEC MGIT 960 及其配套试剂均由美国BD 公司提供（批号20160301）。

1.5 方法留取所有研究对象1 份晨痰或肺泡灌洗液（BALF）样本。BALF 视清浊度不同，对于带有黏液的BALF 标本可适量加入一些4%NaOH 溶液进行液化，最多不超过样本量的1 倍体积。

涂片检查：遵照《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[7]中的标准化操作程序执行。培养检查：吸取2mL 待检标本至50mL 离心管中，严格按照BACTEC MGIT 960 系统操作说明书进行操作，培养时间设定为42 天。仪器报告阳性后，取培养液进行涂片镜检，若查到抗酸杆菌则为阳性；若未见抗酸杆菌则为阴性。

TB SAT 检测：将待检标本用13000r/min 离心5min，弃上清液，加入50μL 裂解缓冲液，重悬后放入超声清洗器中超声处理15min，超声功率为300W。阳性对照和阴性对照与待检标本同步进行。超声结束后，取2μL 处理物加入预先混合好的30μL 扩增检测液中。再将反应管置于干热恒温器上60℃保温1min后，再置于42℃保温5min，同时将酶液预热至42℃。预热后，向每支反应管中加入10μL 酶液，混匀后将反应管快速转至7500 型实时荧光定量PCR 仪中启动反应程序。反应程序为荧光通道设定为FAM，每个循环为42℃、1min，共40 个循环。

1.6 统计学方法采用SPSS 18.0 软件进行数据分析，定量资料以均数±标准差（）表示，正态性检测采用Kolmogorov-Smirnov 检验；正态分布数据组间比较采用t 检验，非正态分布数据组间比较采用Wilcoxon 检验；率的比较采用卡方检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 272 例患者中，培养阳性肺结核患者85 例，培养阴性经过临床诊断肺结核患者95例，年龄（36.17±13.15）岁；非结核患者92 例，年龄（43.25±15.33）岁，其中肺炎68 例（73.91%）、支气管扩张7 例（7.61%）、肺癌7 例（7.61%）、真菌感染7 例（7.61%）、非结核分枝杆菌肺病3 例（3.26%）。

2.2 涂片、培养及TB SAT 检测结核分枝杆菌的效能评价以临床诊断结果为金标准[6]，确认活动性肺结核病180 例，非结核病患者92 例。涂片、培养、TB SAT 检测结核分枝杆菌的灵敏度分别为26.11%、47.22%及59.44%。TB SAT 的检测灵敏度明显高于涂片（χ2=40.852，P＜0.01）和培养（χ2=5.402，P＜0.05），差异有统计学意义。见表1。

2.3 TB SAT 检测诊断涂阴肺结核的效能以临床诊断结果为金标准[6]，133 例涂阴肺结核患者：培阳41 例，培阴92 例；TB SAT 阳性60 例（涂阴培阳肺结核患者阳性37 例，涂阴培阴肺结核患者阳性23例），TB SAT 阴性73 例；92 例非结核患者：TB SAT阳性1 例，阴性91 例。TB SAT 诊断涂阴肺结核的灵敏度为45.11%（60/133），特异度为98.91%（91/92），阳性预测值为98.36%（60/61），阴性预测值为55.49%（91/164）。见表2。

2.4 疗效评估 TB SAT 检测阳性患者治疗3、6 个月后，TB SAT 阳性率分别为66.67%（30/45）及21.74%（5/23），阳性率明显下降，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。

3 讨论

对早期结核患者进行快速准确诊断是目前结核防控的难点，目前已有的常规检测很难满足临床的需求[8-9]。本研究采用的结核RNA 检测（TB SAT）技术原理是以16S rRNA 为靶标，通过恒温RNA 扩增检测技术（SAT），快速准确地判断待检样本中是否有结核分枝杆菌的存在[10]，还能够区分死菌活菌，因此这种方法可有效辅助诊断肺结核病、以及评估抗结核治疗疗效[11]。

本研究采用疑似肺结核患者的BALF 标本，比较涂片镜检、培养、TB SAT 方法的诊断性能。本研究发现，TB SAT 的灵敏度明显优于培养以及涂片法，而特异度与培养以及涂片法相当；提示TB SAT 检测具有高灵敏度高特异度的优势，能更好的帮助临床医生进行早期诊断和治疗。进一步的分析发现，TB SAT检测在涂阳培阳患者中的灵敏度及特异度高达100%、在涂阴培阳患者中的灵敏度高达90.24%、在涂阴培阴患者的灵敏度为25.00%。这表明TB SAT检测在涂片阳性患者或培养阳性患者中，均表现出了优异的检测性能；由于TB SAT 还可进一步提升在涂阴培阴患者中的检出率，提示其临床应用价值与培养相当甚至可能略高，可更好的辅助临床医生对涂阴或菌阴患者进行早期诊断和治疗[3，12-13]。