青藤碱对小鼠急性肺损伤保护作用及机制研究

管静静

青藤碱是从中草药青藤中提取的一种活跃的生物碱。青藤碱可调节免疫反应通过抑制淋巴细胞的活化，减少巨噬细胞炎症因子的产生[1]，对多种自身免疫性和炎症相关疾病具有良好的效果[2-4]。青藤碱能有效抑制核因子κB（NF-κB）的抑制蛋白（IκB）磷酸化及后续降解反应，导致NF-κB 下游炎症基因转位和转录的减少[5]。急性肺损伤与过度的炎症反应以及NF-κB 信号通路的激活密切相关，同时青藤碱具有明显的改善脂多糖（LiPoPoly-saccharide，LPS）诱导的急性炎症的功效[3-4]。然而青藤碱对于急性肺损伤的作用尚未进行深入研究。因此，本研究拟通过LPS 诱导急性肺损伤模型炎症探索青藤碱对急性肺损伤的保护作用。

1 实验材料

1.1 动 物 雄性C57BL/6J 小鼠48 只，体质量20～30g，由温州医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（京）2012-0001，动物伦理审批号wydw 2015-0182。动物饲养在温州医科大学实验动物中心，SPF 环境，温度、湿度、换气次数由IVC 系统自动控制，光照为12h 明、12h 暗循环。自由摄食饮水，饲料由浙江省实验动物中心提供，饮水为纯净水。

1.2 药品与试剂 青藤碱（德思特生物，中国，DQ0008）；LPS（Sigma 公司，美国，L2630）；肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factorα，TNF-α）（R&D 公司，美国，MTA00B）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（R&D 公司，美国，M6000B）、IL-1β（Thermo，美国，BMS6002）、单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）（赛默飞，美国，BMS6005）酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（碧云天，中国，P0012）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（碧云天，中国，C0109）；表面抗原分化簇68（CD68）抗体（Abcam，美国，ab125212）；驴抗兔荧光二抗（Alexa Fluor 647）（Abcam，美国，ab150075）；即用型免疫组化试剂盒（迈新生物，中国，KIT-9720）。

1.3 仪 器 Varioskan Flash 酶标仪（Thermo，美国）；E3000-0.5 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂），BX51 倒置荧光显微镜（OlymPus，日本）。

2 实验方法

2.1 分组、模型制备及给药 选用C57BL/6J 小鼠48 只，采用随机数字表法随机分成四组，假手术组、模型组、青藤碱低剂量组（40mg/kg），青藤碱高剂量组（160mg/kg），每组12 只。急性肺损伤模型制备：术前12h 禁食，自由饮水；采用1%戊巴比妥钠，75mg/kg腹腔内注射麻醉；仰卧位，四肢外展固定后直立固定板；采用留置针进行气管插管，1mL 注射器注入50μL 生理盐水形成液柱后插入留置针，液柱随小鼠呼吸上下浮动为插入气道成功；LPS（0.5mg/kg）滴注留置针后，使用1mL 注射器将LPS 推入气道。假手术组采用同样操作，气道给予同剂量的生理盐水。青藤碱治疗组小鼠造模前3 天每天腹腔注射相应剂量的青藤碱。建模后6h，处死小鼠，取外周血与肺部组织进行检测。

2.2 测定指标

2.2.1 血清炎症因子测定 建模后6h，处死小鼠，行眼球取血300～500μL，以3000rpm、离心半径8.5cm，离心5min，收集上清，按照试剂盒说明书检测血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1。

2.2.2 肺组织病理切片与免疫组化染色 取出未经灌洗的左肺下叶放入福尔马林中固定，24h 后脱水，透明，石蜡包埋处理，5μm 切片，HE 染色与CD68 免疫组化染色。HE 染色步骤根据试剂盒说明书进行，其中苏木素染色5min，伊红染色10s。CD68 免疫荧光染色前期根据即用型免疫组化试剂盒步骤操作，一抗稀释比例1:200，荧光二抗稀释比例1:10000，二抗孵育完毕4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色5min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗净，抗荧光淬灭剂封片镜检。观察肺脏组织形态病理学变化，观察有无肺水肿，以及通过Image J 软件对同一组织切片的6 个不同视野进行阳性细胞计数统计，观察巨噬细胞炎症细胞浸润情况。

2.2.3 肺组织胞外信号调控激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）/核因子κB（nuclear factor kaPPa-B，NF-κB）信号通路检测 剪取未经肺泡灌洗的肺脏组织约100mg，剪碎匀浆，以12000rpm、离心半径8.5cm，离心20min，收集上清，考马斯亮蓝定量，100℃水浴使蛋白变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF），转膜结束后，5%脱脂牛奶封闭常温孵育1h，一抗稀释比例1:1000，4℃冷库孵育过夜，PBST洗3 次，每次7min，二抗稀释比例1：10000，室温孵育1.5h，PBST 洗3 次，每次7min，化学发光法（ECL）显影，凝胶成像系统检测蛋白表达，GAPDH 为内参。

表1 各组小鼠血清炎症因子水平比较（pg/mL，）

表1 各组小鼠血清炎症因子水平比较（pg/mL，）

注：假手术组给予气道滴注生理盐水（0.5mg/kg）；模型组给予气道滴注脂多糖（0.5mg/kg）；青藤碱低剂量组给予脂多糖（0.5mg/kg）+青藤碱（40mg/kg）；青藤碱高剂量组给予脂多糖（0.5mg/kg）+青藤碱（160mg/kg）；IL-1β 为白介素-1β；MCP-1 为单核细胞趋化因子1；TNF-α 为肿瘤坏死因子α；IL-6 为白介素-6；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与青藤碱低剂量组比较，cP＜0.05

2.3 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件，数据以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用t 检验进行两组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 对小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平的影响 LPS 诱导急性肺损伤模型小鼠血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平明显升高（P＜0.05），表明模型组小鼠LPS 刺激后，肺部发生炎症，模型构建成功。给予青藤碱后小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 水平明显降低（P＜0.05），并具有剂量依赖性（P＜0.05）。见表1。

3.2 肺组织病理学检查结果 镜检HE 染色与CD68 免疫组化染色显示，LPS 刺激后，模型组小鼠肺脏发生明显的炎症病变，肺部出现大量炎症细胞聚集、迁移并表现出弥漫性水肿，同时伴有肺泡壁增厚、肺泡腔萎缩等，提示造模成功。给予青藤碱能明显改善上述病理变化，并具有剂量依赖性。见插页图1。

图1 肺部病理变化及巨噬细胞浸润情况（HE 200×，CD68 400×）

3.3 肺组织ERK/NF-κB 信号通路被抑制 Western blot 结果显示，模型组肺脏组织ERK/NF-κB 信号通路被激活，ERK1/2 的磷酸化水平明显升高，IκB 降解明显，青藤碱低、高剂量组ERK/NF-κB 信号通路明显被抑制，ERK1/2 磷酸化水平明显低于模型组，IκB降解程度明显降低，并且对ERK/NF-κB 的抑制作用呈现剂量依赖性。提示青藤碱可能通过抑制ERK/NF-κB 信号通路缓解肺损伤，并具有剂量依赖性。见表2，插页图2。

图2 ERK/NF-κB 信号通路激活情况

4 讨论

急性肺损伤是一种严重的急性炎症性疾病，是危重症医学研究的一个主要问题[6]。通过气管内滴入LPS 诱导急性炎性反应诱发急性肺损伤是目前使用最多的急性肺损伤模型[7-8]。青藤碱为中草药青风藤提取物，目前主要用于治疗慢性炎症，如风湿性关节炎、慢性肾炎等[9-10]。但青藤碱的保护作用在急性肺损伤中的研究较少。因此本研究采用LPS 气道滴注诱导急性肺损伤模型，探讨青藤碱对急性肺损伤的保护作用。

表2 各组小鼠肺组织ERK/NF-κB 信号通路

过度的炎症因子（TNF-α、IL-6）表达是炎症性疾病急性期的重要标志。在本研究中，LPS 气道滴注引发小鼠全身炎症反应，血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1 含量均明显升高，青藤碱可以明显抑制炎症因子的释放，降低血清炎症因子水平。这也证实了青藤碱可以通过抑制炎症反应缓解急性肺损伤。此外，青藤碱具有良好的免疫抑制作用，可以有效抑制炎症细胞浸润，缓解机体损伤。病理切片结果显示，青藤碱对肺组织损伤具有良好的保护作用，并可以有效抑制巨噬细胞浸润。青藤碱对ERK/NF-κB信号通路的抑制在不同的疾病模型中已经得到了证实[11-14]。在本研究中，LPS 气道滴注引起ERK/NF-κB信号通路的激活，具体表现为ERK 的磷酸化水平增高以及IκB 的降解，而青藤碱可以明显抑制上述反应。

综上所述，本研究发现青藤碱对LPS 诱导急性肺损伤发挥保护作用，通过ERK/NF-κB 信号通路对炎症因子具有显著抑制作用，并缓解LPS 诱导的组织损伤。