真武汤在缩窄性心包炎患者围术期应用价值及其机制研究

钟方明 杨 俊 朱鹏飞 陈 达

缩窄性心包炎常因心包慢性炎症导致心包增厚、粘连甚至钙化，致使心功能恶化，长期临床预后不良，一经确诊应尽早进行缩窄心包的剥脱与切除[1-2]。目前临床常规采取术前积极纠正低蛋白血症、利尿消肿、胸腹腔引流等措施改善围术期心功能，但临床疗效有限，且易诱发水电解质紊乱。真武汤出自张仲景《伤寒论》，有温阳化气利水之功，可有效改善心衰证候。研究证实，真武汤及其衍生组方能通过减轻心肌纤维化、肥大等病理性组织重塑，改善心功能[3-4]。本研究探讨真武汤在缩窄性心包炎围手术期的治疗效果，初步研究其抑制心包组织纤维化改善心功能的具体机制，报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 纳入2013 年9 月—2018 年12 月期间于浙江省中西医结合医院胸外科住院治疗并确诊为缩窄性心包炎患者80 例，中医辨证分型为阳虚水泛证，按随机数字表法分为对照组和真武汤组，每组40 例。本研究方案经我院伦理委员会审核通过，符合《赫尔辛基宣言》相关要求，与所有受试者及家属均签署知情同意书。

1.2 诊断标准 缩窄性心包炎诊断参考2004 年欧洲心脏病学会制订的心包疾病诊断与治疗指南[5]；中医辨证分型标准参照第2 版《中医诊断学》[6]。

1.3 纳入、排除标准 纳入标准：（1）符合缩窄性心包炎西医诊断及阳虚水泛证中医辨证分型标准者；（2）心功能Ⅱ～Ⅲ级；（3）年龄＜75 岁；（4）受试者自愿配合，依从性好。排除标准：（1）合并其他严重器质性疾病者；（2）合并有意识障碍或精神疾病者。

1.4 药物及主要试剂 真武汤煎剂（茯苓、白芍、生姜各45g，白术30g，制附子15g，购于杭州华东中药饮片有限公司），每剂加水煎成200mL。恒温离心机（上海安亭科学仪器厂制造，型号：TDL－40B）；实时荧光定量PCR 仪ABI7500（美国Applied Biosystems公司）。Human NT Pro-BNP DuoSet ELISA 试剂盒购自美国R&D 公司（批号DY3604-05）。I 型胶原蛋白（Collagen I）、Ⅲ型胶原蛋白（Collagen Ⅲ）、弹性蛋白（Elastin）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物委托上海Sangon 合成。Collagen I 引物序列参数：上游5'-GACCGATGGATTCCAGTTCG-3'，下游5'-TGTGACTCGTGCAGCCATCG-3'；Collagen Ⅲ引物序列参数：上游5'-AGATGTCCTTGATGTGCAGC-3'，下游5'-CCACCAATGTCATAGGGTGC-3'；Elastin 引物序列参数：上游5'-CCTCAAAGCTGGATTCGCTCT-3'，下游5'-GGCAAGGTGGCTATTCCCA-3'；MMP-1 引物序列参数：上游5'-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3'，下游5'-CTGCTTGACCCTCAGAGACC-3'；MMP-2 引物序列参数：上游5'-AGGGCACATCCTATGACAGC-3'，下游5'-ATTTGTTGCCCAGGAAAGTG-3'；MMP-9 引物序列参数：上游5'-CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游5'-GATTTCGACTCTCCACGCATCT-3'；MMP-13 引物序列参数：上游5'-GCTGCCTTCCTCTTCTTGAG-3'，下游5'-TGCTGCATTCTCCTTCAGGA-3'；TIMP-1 引物序列参数：上游5'-TTGGCTGTGAGGAATGCACA-3'，下游5'-TTTTCAGAGCCTTGGAGGAGC-3'；TIMP-2 引物序列参数：上游5'-GCAAGATGCACATCACCC-3'，下游5'-CGTCACTTCTCTTGATGC-3'；GAPDH 引物序列参数：上游5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。磷酸酶抑制剂混合物-1（批号P2850）和二抗（兔）（批号A8257） 购自Sigma-Aldrich 公司；TGF-β1（批号#3709S）、p-Smad2（批号#3108S）、p-Smad3（批号#9520S）一抗均购自Cell'Signaling'Technology 公司；超敏ECL 化学发光试剂盒（NCM'Biotech）购自新赛美生物科技有限公司（批号P10010）。

2 方 法

2.1 治疗方法 所有患者均经胸骨正中切口径路施行心包剥除术，按先左心后右心的顺序剥离增厚心包。切开左心前增厚的心包，顺序游离心尖、左室前壁和侧壁心包并予以切除。心包切除范围：两侧至膈神经前缘，上至大血管根部，下至膈面及心尖，并松解上下腔静脉入口瘢痕组织。两组患者围手术期治疗均予以术后抗感染、抗结核（结核性心包炎患者）、强心利尿、维持电解质平衡及水的负平衡、激素治疗及胸腹腔引流等常规方案治疗[5]。真武汤组术前1 周在常规治疗基础上加用真武汤，药物：茯苓、白芍、生姜各45g，白术30g，制附子15g，加水煎煮至200mL，1 天1 剂，分早晚2 次口服，总疗程为2 周。

2.2 心功能指标检测 于术前及术后第8 天晨起时空腹抽取每位患者静脉血5mL，离心处理4000r/min，8min，取其上清液，置于-18℃恒温箱中留存。采用ELISA 法分别检测其血浆NT-proBNP 的水平，并行超声心动图检查两组治疗前后左室舒张末期内径（LVEDD）和左室收缩末期内径（LVESD）、左室射血分数（LVEF）。

2.3 病理组织形态学观察 取存档的石蜡包埋心包组织标本，保证切片完整、厚度均匀（4～6μm），彻底脱水透明，用中性树胶封盖。最后苏木精液染色后，光镜下观察心包组织的病理特征。

2.4 RT-qPCR 检测相关基因转录水平 取新鲜心包组织标本，采用Trizol 法提取总RNA，测OD 值（RNA OD280/OD260 为1.9）。反转录（Reverse Transcription，RT）以Takara 公司附带的产品说明书为标准，合成cDNA。采用SYBR Green I 荧光染料技术进行定量聚合酶链式反应（quantitative Polymerase Chain Reactionq，qPCR）。实验中每个样本设置3 个复孔，所有原始数据采用LightCycler 96 SW 1.1 软件进行分析，以GAPDH 作为内部参照。

2.5 Western blot 检测相关蛋白表达 取液氮冻存的心包组织样本，研碎后加入RIPA 裂解液，冰上孵育30min，12000rpm 离心后取上清液，BCA 法测定并调整样本蛋白浓度，加Loading Buffer 95℃变性5min，-20℃保存。取各组样本10μg 进行上样，在10% SDS-PAGE 胶中电泳（浓缩胶80V，分离胶120V），并湿转至PVDF 膜上（300mA 恒流90min），用5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入对应一抗（1:1000稀释），4℃冰箱摇床（转速40rpm）过夜。TBST 洗涤10min×3 次（转速80rpm）。然后，加入山羊抗兔二抗孵育2h（1:5000 稀释），再次以TBST 洗涤10min×3次。最后用超敏ECL 化学发光试剂盒（A:B 液=1：1）显色，原始图像采用Imgae J 软件处理，以GAPDH（1:5000 稀释）为内部参照，相对灰度值以与GAPDH比值结果表示。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件进行实验数据分析。计数资料以例（n）表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（） 表示，两组间数据比较采用t 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 两组缩窄性心包炎患者一般资料比较 对照组40 例，男21 例，女19 例；年龄42～75（57.1±5.8）岁；心功能Ⅱ级15 例，Ⅲ级25 例；病程4～16（8.8±4.3）年。真武汤组40 例，男18 例，女22 例；年龄46～75（58.6±5.2）岁；心功能Ⅱ级14 例，Ⅲ级26 例；病程3～14（7.9±3.2）年。两组患者基线资料，包括性别、年龄、心功能分级以及病程方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3.2 两组缩窄性心包炎患者血浆NT-proBNP 以及心功能指标比较 两组患者行心包剥除术前血浆NT-proBNP 以及心功能指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而心包剥除术后，两组血浆NT-proBNP及心功能指标均有所改善，且真武汤组患者比较对照组血浆NT-proBNP、LVEDD、LVESD 水平有所降低，LVEF 则显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.3 两组缩窄性心包炎患者心包组织病理 对照组心包组织中胶原纤维含量增多、玻璃样变性，且有明显钙化；真武汤组胶原纤维含量降低，玻璃样变性程度相对减轻。见插页图1。

图1 两组缩窄性心包炎患者心包组织病理变化（HE 染色400×）

3.4 两组缩窄性心包炎患者心包组织纤维化相关基因转录水平比较 RT-qPCR 表明真武汤组心包组织Collagen I 和Collagen Ⅲ表达量较对照组有所降低，Elastin 表达量相对增高（P＜0.05）。且比较于对照组，真武汤组患者心包组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 转录水平以及MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 比率明显降低，MMP-1 和MMP-13 转录水平及MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 比率均显著增高，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3.5 两组缩窄性心包炎患者心包组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表达水平比较 Western blot 显示，真武汤组心包新鲜标本提取物TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表达量较对照组显著降低，见表3、插页图2。

表1 两组缩窄性心包炎患者血浆NT-proBNP 以及心功能指标比较（）

表1 两组缩窄性心包炎患者血浆NT-proBNP 以及心功能指标比较（）

注：对照组给予常规方案治疗；真武汤组常规治疗基础上加真武汤治疗；NT-proBNP 为N 末端脑钠肽；LVEDD 为左室舒张末期内径；LVESD 为左室收缩末期内径；LVEF 为左室射血分数；与本组治疗前比较，aP＜0.05；与对照组同期比较，bP＜0.05

表2 两组缩窄性心包炎患者心包组织纤维化相关基因转录水平比较（）

表2 两组缩窄性心包炎患者心包组织纤维化相关基因转录水平比较（）

注：对照组给予常规方案治疗；真武汤组常规治疗基础上加真武汤治疗；Collagen I 为I 型胶原蛋白；Collagen Ⅲ为Ⅲ型胶原蛋白；Elastin 为弹性蛋白；MMP-1 为基质金属蛋白酶-1；MMP-2 为基质金属蛋白酶-2；MMP-9 为基质金属蛋白酶-9；MMP-13 为基质金属蛋白酶-13；TIMP-1为基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；TIMP-2 为基质金属蛋白酶组织抑制因子-2；GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；GAPDH 作为内参，结果以mRNA/GAPDH 比率表示；与对照组比较，aP＜0.05

图2 两组缩窄性心包炎患者心包组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表达

表3 两组缩窄性心包炎患者心包组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表达水平比较（）

表3 两组缩窄性心包炎患者心包组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 表达水平比较（）

注：对照组给予常规方案治疗；真武汤组常规治疗基础上加真武汤治疗；TGF-β1 为转化生长因子-β1；p-Smad2 为磷酸化Smad 蛋白2；p-Smad3 为磷酸化Smad 蛋白3；GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶；与对照组比较，aP＜0.05

4 讨论

真武汤在临床上常用于治疗阳虚水泛证候，临床及动物实验证实，真武汤及其衍生组方具有强心、利尿、减轻心肌纤维化、消除自由基、改善心功能等疗效[7-8]。本实验将真武汤应用于缩窄性心包炎围术期的联合治疗，结果表明，真武汤组患者NT-proBNP及LVEDD、LVESD、LVEF 等心功能指标较对照组明显改善（P＜0.05），其临床疗效得到证实。有文献显示，缩窄性心包炎发病基础是病理性组织重塑，表现为纤维组织增生、玻璃样变性、炎细胞浸润、心包钙化等[9]。亦有研究证实，纤维化是心包缩窄的始发因素，其病理特征主要表现为细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分的增加，包括Collagen、Elastin、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等[10]。本实验中，HE 染色显示缩窄性心包炎患者心包组织胶原纤维含量增多、弹性纤维减少，并出现纤维断裂、玻璃样变性等组织重塑特征，而真武汤组心包组织纤维化程度有所减轻，提示真武汤可能改善心包组织纤维化。

心包组织纤维化的直接原因是由基质金属蛋白酶（MMPs）和基质金属蛋白酶抑制物（TIMPs）失衡介导的ECM 平衡失调。MMPs 是一组结构相关的细胞外锌内切肽酶，已知它们能够切割ECM 的多种成分[11]，可促进纤维胶原降解，能被特定的TIMPs 所抑制[12]。MMPs/TIMPs 比例异常降低将导致ECM 组分合成和沉积增加，降解减少，MMPs 被认为是病理条件下组织重构的关键因素。而TIMPs 是一种特异的内源性抑制剂，对MMPs 的活动进行严格调控，防止基质过度退化[13]。其中MMP-2，MMP-9 又称Ⅳ型胶原酶，可增加Collagen/Elastin 比率，引起ECM 沉积；而MMP-1，MMP-8，MMP-13 具有抗纤维化作用，有研究证实其过表达可抑制胶原沉积，改善组织纤维化[14]。这与我们的实验结果一致，本实验RT-qPCR验证真武汤组心包组织Collagen I 和Collagen Ⅲ表达量较对照组有所降低，而Elastin 表达量相对增高（P＜0.05）。另外比较于对照组，真武汤组心包组织MMP-2/TIMP-2 和MMP-9/TIMP-1 的比值有所降低，MMP-1/TIMP-1 和MMP-13/TIMP-1 的比值显著增高（P＜0.05），表明真武汤可有效调节纤维化相关基因的转录水平。

转化生长因子-β（TGF-β）是ECM 成分表达和纤维化发展的主要调节因子，其中TGF-β1 是心脏成纤维细胞活化和纤维化的重要介质[15-16]。相关研究显示，在不同类型心包炎患者心包液和血浆转化生长因子-β1 水平的升高与胶原合成增加有关[17-18]。在经典的TGFβ 信号通路中（Smad 依赖性），TGF-β 信号主要由Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体介导[19]，TGFβ 受体的活化导致Smad2/3（即TGF-β 亚家族的Receptor-regulated Smad，R-Smad）的磷酸化。随后活化的R-Smad 与Co-mediator Smad（Co-Smad，即Smad4）形成异构体并转移到细胞核中，进一步调节靶基因的表达[20-21]。本研究Western blot 证实真武汤组心包组织TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 水平较对照组有所降低，表明真武汤可能通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路调节下游纤维化相关基因表达水平改善心包纤维化。

综上所述，真武汤可能通过下调TGF-β1/Smads信号通路调节MMPs/TIMPs 平衡，阻止ECM 沉积，抑制心包组织纤维化，从而改善缩窄性心包炎患者的围术期心功能。