环状RNA CDR1as与miR-7在癫痫患者血浆中的表达及与脑电图异常的关系分析

韩永凯，李斯娜，张萍，李静，王旭生，张帆，杜爱玲，张留莎，宋景贵△

癫痫是脑神经元突发间歇性痫样放电引起脑部短暂功能障碍的中枢神经系统综合征，以神经元过度、反复同步异常放电为主要特征，死亡危险性较高，是一般人群的2～3 倍［1-2］。全球约有 5 000 万癫痫患者，其中中国癫痫患者约有600万，每年新发癫痫患者约有40万［3］。而经过规范治疗后，通常1/3癫痫患者不能完全控制发作，严重影响患者的正常生活［4］。因此，探索与癫痫发病有关的生物学指标，对于临床监测及治疗癫痫有重要意义。研究发现，微小RNA（microRNA，miRNA）参与退行性神经病变及脑缺血所致神经损伤过程，在癫痫的发生中具有重要作用［5］。miR-7 是 miRNA 家族重要成员，在脑组织中表达水平较高，参与脑部炎症以及相关疾病发生［6］。小脑变性相关蛋白1 反义转录物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一种环状RNA，可通过miR-7 途径间接调控miR-7靶基因，影响疾病的发生发展［7］。但 CDR1as 和miR-7在癫痫中的作用尚不明确。本研究将通过检测癫痫患者血浆中CDR1as和miR-7的表达水平，初步探讨两者与患者脑电图异常的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016 年12 月—2019 年12 月在新乡医学院第二附属医院门诊及住院的癫痫患者87例为观察组，结合脑电图、磁共振成像结果确诊为原发性癫痫者。选取同期健康体检者90例为对照组。收集2组性别、年龄和体质量指数（BMI）。排除标准：（1）合并其他脑组织病变，急慢性炎症性疾病，自身免疫性疾病，心、肝或肾等重要脏器损伤，恶性肿瘤，严重胃肠道疾病，精神疾病，甲状腺功能障碍及其他代谢性疾病者。（2）由脑血管意外、颅内感染等颅内病变导致的继发性癫痫者。（3）有药物、乙醇依赖史者。本研究经本院伦理委员会审核，符合相关伦理学规定，所有研究对象知情且签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 TRIzol 试剂（货号：QN2070-ZOG）购自北京百奥莱博科技有限公司；反转录试剂盒（货号：BPI01030）购自北京华大蛋白质研发中心有限公司；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）试剂盒（货号：DEM202-50T）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；白细胞介素（IL）-2、肿瘤坏死因子-α（TNF）-α、IL-1β酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号：SEKCN-0007-96Time、SEKRT-0402-96Time、SEKMY-0002-96Time）购自北京索莱宝科技有限公司；qPCR 引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。qPCR 仪（型号：QuantStudio 6 Flex）购自Life Technologies公司，酶标仪（型号：Varioskan LUX）购自Thermo Fisher公司。

1.3 血浆的检测 清晨抽取受试者空腹外周静脉血6 mL，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取血浆，分成2份。其中一份采用qRT-PCR法检测，即按照TRIzol试剂盒说明书提取血浆中总RNA，使用紫外分光光度计检测RNA质量，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA 完整性，使用反转录试剂盒反转录合成cDNA，检验cDNA 质量。以GAPDH、U6 为内参基因。反应条件为：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 40次。CDR1as 上游引物 5´-TAGTACGTCGTGCCCTGA-3´，下游引物5´-CACTTGACGTGCAGCATC-3´，产物大小2 116 bp；miR-7 上游引物 5´-CCACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3´，下游引物 5´-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3´，产物大小21 bp；内 参 GAPDH 上 游 引 物 5´-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3´，下游引物5´-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3´，产物大小1 285 bp；内参U6上游引物5´-CTCGCTTCGGCAGCACA-3´，下游引物 5´-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3´，产物大小 207 bp。采用 2-ΔΔCt法计算血浆 CDR1as、miR-7 相对表达量。取另外一份血浆应用ELISA法检测，具体操作均按照试剂盒说明书进行。使用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算血浆 IL-2、TNF-α 和 IL-1β水平。

1.4 脑电图检查 采用脑电图仪对癫痫患者进行检查，按照国际10/20 系统安置电极，采用常规单极和双极导联描记脑电图波形。检查过程中，对患者进行闪光刺激及过度呼吸诱发试验，描记时间均超过20 min。由本院脑电图室高资历医生根据脑电图作出诊断并依脑电图结果将87 例癫痫患者分为正常组（6 例）、轻度异常组（18 例）、中度异常组（37 例）及重度异常组（26 例）。正常：α 或β 节律为主，左右对称；轻度异常：α 节律不规则或不稳定，出现高波幅β 波，同时Q 波在各区的活动增加；中度异常：α 节律不对称且可能消失，Q 波阵发性发作，过度换气后高波幅δ 波成群出现；重度异常：Q 波、δ 波弥散性发作，α 波变慢甚至消失，δ 波阵发性出现，且可自发或诱发高波幅的棘波、棘慢综合波、尖波。

1.5 统计学方法 应用SPSS 24.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，2 组间比较行独立样本t检验；多组间比较行单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；计数资料均以例（%）表示，组间比较行χ2检验。相关性分析采用Pearson 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组受试者一般资料比较 5组受试者性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不同程度脑电图异常癫痫患者病程比较差异亦无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

Tab.1 Comparison of the general data between the five groups of patients表1 5组受试者一般资料比较

2.2 5 组受试者血浆CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β 水平比较 对照组、正常组、轻度异常组、中度异常组、重度异常组的血浆CDR1as、IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平总体呈升高变化，miR-7 水平总体呈降低变化（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5组受试者血浆CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比较 （）

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5组受试者血浆CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比较 （）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与正常组比较，c与轻度异常组比较，d与中度异常组比较，P＜0.05

组别对照组正常组轻度异常组中度异常组重度异常组F n 90 6 18 37 26 CDR1as 1.01±0.08 1.09±0.08 1.18±0.09a 1.25±0.11ab 1.33±0.13abcd 78.656＊＊miR-7 1.03±0.18 0.94±0.14 0.80±0.12a 0.61±0.09abc 0.53±0.11abcd 87.708＊＊IL-2（μg/L）146.45±27.86 175.64±11.65a 193.23±14.82a 229.86±20.86abc 246.32±16.44abc 137.916＊＊组别对照组正常组轻度异常组中度异常组重度异常组F TNF-α（μg/L）87.53±14.08 88.62±12.02 104.41±12.84a 137.08±13.65abc 144.42±14.57abc 137.321＊＊IL-1β（μg/L）47.65±13.69 63.52±8.02a 81.49±10.68ab 100.43±11.37abc 109.95±12.08abcd 193.765＊＊

2.3 癫痫患者血浆CDR1as、miR-7 水平与IL-2、TNF-α和IL-1β水平的相关性分析 相关性分析结果显示，癫痫患者血浆CDR1as 水平与IL-2、TNF-α和 IL-1β 水平呈正相关（r分别为 0.416、0.428 和0.443，P＜0.05），miR-7 水平与 IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平呈负相关（r分别为-0.483、-0.455 和-0.507，P＜0.05）。

3 讨论

癫痫是较为常见的神经科疾病，是由多种原因引起的慢性脑功能紊乱所致的中枢神经系统综合征。癫痫患者脑内病灶部位的神经细胞放电异常会引起运动、感觉、意识、行为及自主神经的不同障碍，通常反复发作，但亦可自然缓解。75%～80%癫痫患者首次发作在18 岁以前，但成年人、老年人发病也不少见。流行病学调查显示，癫痫的发病率为1%～2%［8］。然而，20%～30%患者使用一种甚至多种抗癫痫药物治疗的效果均较差，仍反复发作，影响患者身体及心理健康［9］。有研究显示，癫痫的发生发展与炎症反应有关，癫痫发病可激活炎症细胞释放炎症细胞因子，发生全身炎症反应，进而引起相应血清学指标的改变［10］。因此，寻找与癫痫炎症反应发生有关的指标，阐明其分子机制，寻找新的分子治疗靶点，进行有效的干预阻断对临床治疗具有重要意义。

miRNA 是一类长度为19～25 个核苷酸的单链非编码RNA，通过在转录或转录后水平调控靶基因表达，参与疾病的发生发展［11］。近年来研究发现，miRNA 在脑部炎症、癫痫的发生发展中起关键作用［12-13］。miR-7 在癫痫中的作用尚少见报道，但有研究表明，miR-7在脑组织中表达水平较高，在脑组织炎性损伤的发生发展中起重要作用［6，14］。环状RNA 是一类缺乏 5´、3´末端共价结合的单链RNA 环状分子，具有稳定保守、组织特异性及发育阶段特异性表达等特点［15］。CDR1as 是一种与多种肿瘤及神经性疾病发生相关的环状RNA，其可通过竞争性内源RNA 途径阻碍miR-7 功能或发挥miR-7 的海绵作用，大量储存 miRNA-7 并适时释放［16］。Yang等［17］研究表明，CDR1as 可充当miR-7 海绵，将其沉默后可增强乳腺癌细胞对药物的敏感性。另有研究表明，CDR1as在胶质瘤组织中表达水平显著低于正常脑组织，因此其认为环状RNA CDR1as 可能是作为抑癌基因参与调控胶质瘤的恶性生长［7］。本研究结果显示，各组癫痫患者较健康体检者血浆CDR1as 水平显著升高，miR-7 水平显著降低，且随着患者脑电图异常发生及脑电图异常程度加重，血浆CDR1as 水平依次升高，miR-7 水平依次降低，提示CDR1as、miR-7 参与癫痫发生发展，并与患者脑电图异常程度有关，但具体机制还需进一步研究。

众多研究表明癫痫的发生发展与炎症反应有关。Zhou等［18］研究发现，高迁移率族蛋白（HMGB）-1、IL-2和IL-6等炎症因子参与癫痫发生发展过程。韦倩娜等［19］研究发现，TNF-α、IL-1β 参与癫痫发生，与患者脑电图异常程度有关。本研究结果显示，各组癫痫患者较健康体检者血浆IL-2、TNF-α 和IL-1β 水平显著升高，且随脑电图异常发生及程度加重而逐渐升高，提示IL-2、TNF-α、IL-1β 参与癫痫患者的炎症反应过程，在癫痫发生发展中发挥重要作用，且其水平与脑电图异常存在一定关系，与恽鸿博等［20］研究结果一致。神经系统中TNF-α 主要由胶质细胞产生的，当癫痫发作时，血脑屏障遭到破坏后，TNF-α通过血脑屏障进入脑内，同时神经元异常放电以及周围神经胶质细胞也会促进TNF-α 的合成和分泌，参与癫痫疾病的发生；另外TNF-α 还可通过一系列级联反应促进胶质细胞中IL-2、IL-1β等癫痫相关细胞因子表达，而这些炎症因子又进一步通过加强神经元功能和诱导炎性反应促进癫痫疾病的发生。进一步研究显示，癫痫患者血浆CDR1as水平与IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈显著正相关，miR-7水平与IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈显著负相关，提示CDR1as、miR-7 与IL-2、TNF-α、IL-1β 密切相关，推测CDR1as、miR-7 可能通过影响患者体内炎症反应过程影响疾病的发生发展，但是由于目前关于CDR1as、miR-7在癫痫发生发展中作用机制的研究较少，两者对癫痫的作用机制尚不明确，还有待进一步分析。

综上所述，血浆CDR1as、miR-7 水平与癫痫患者脑电图异常密切相关，分别随着脑电图异常发生及程度加重而升高或降低，两者可能通过影响患者血浆IL-2、TNF-α、IL-1β 水平参与对癫痫患者脑电图异常发生及加重的调控，但CDR1as、miR-7 在癫痫中的具体作用机制还需扩大样本量进行深入研究。