维生素B2在胃癌中的作用及机制研究

周俭，唐朝亮，胡文军△，田添

胃癌是我国最常见的胃肠道恶性肿瘤，2017 年我国胃癌发病率仅次于肺癌而居第2 位（39.78/10万），死亡率居第3 位（25.16/10 万）［1］。尽管外科手术、化疗和靶向药物等治疗手段在胃癌的治疗方面取得了一定的进展，但进展期患者的5 年生存率不足50%［2-3］。维生素B2（Vit B2）又称核黄素，属B 族维生素，是体内黄酶类辅基的重要组成部分。Vit B2积极参与了核苷酸的合成、DNA 甲基化和修复等生化过程，与食管癌［4-5］、结直肠癌［6］、宫颈癌［7］和乳腺癌［8］等恶性肿瘤的发生和发展密切相关。有研究显示，血清高Vit B2 水平可降低胃癌的发病风险［9］。阿帕替尼是我国自主研发的抗肿瘤药物，广泛用于胃癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等恶性肿瘤的治疗［10］。目前临床上已将阿帕替尼与其他药物或治疗方法进行同步联合，得到较单药更好的治疗效果［10-11］，但阿帕替尼与Vit B2联合用药对胃癌的抗肿瘤效应尚少见相关研究报道。本研究对Vit B2水平与胃癌患者临床病理特征的关系进行分析，并探讨Vit B2 协同阿帕替尼对胃癌MGC-803 细胞增殖活性和凋亡的影响，以期为胃癌的精准治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018 年1 月—2019 年4 月阜阳市人民医院肿瘤科收治的胃癌患者（胃癌组）39例，其中男25例，女14例；年龄35～79岁，平均（51.4±15.8）岁，所有患者均经病理学检查确诊为胃癌，且未接受手术或放化疗等治疗。另择我院体检中心同期健康体检者40例为对照组，其中男21例，女19 例，年龄 36～71 岁，平均（49.2±13.2）岁；2 组性别（χ2=1.093）、年龄（t=0.671）差异均无统计学意义。收集胃癌患者的临床资料，包括病理类型、组织学分型、手术情况和既往病史等。本研究经医院医学伦理委员会批准，且获所有研究对象知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 人胃癌MGC-803细胞购自上海中国科学院细胞库。IMDM培养基购自美国Gibco公司；Vit B2购自美国Sigam 公司；阿帕替尼购自江苏恒瑞医药股份有限公司；CCK-8 试剂盒、TRIzol 液和逆转录试剂盒购自瑞士Roche 公司；凋亡试剂盒购自美国BD 公司；乳酸、葡萄糖和琥珀酸脱氢酶检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。细胞培养箱、分光光度计和高速低温离心机购自美国Thermo 公司；实时荧光定量PCR（qPCR）检测仪购自瑞士Roche公司；流式细胞仪购自美国BD Bioscience公司。

1.3 方法

1.3.1 血样采集与检测 所有研究对象均于清晨空腹抽取静脉血3 mL，送安徽华大医学检验所进行检测。操作步骤如下：低温高速离心机3 000×g离心20 min，吸取血清样本，加入Vit B2样品处理液后置于LVK3000维生素检测仪中，严格按照说明书的步骤进行操作，检测血清Vit B2水平。

1.3.2 细胞培养和氧化磷酸化水平检测 将液氮保存的人胃癌MGC-803细胞解冻复苏后，接种于IMDM培养基并置于37 ℃、5%CO2培养箱中。待细胞融合度为80%～90%时，采用0.25%胰酶消化、传代后，取对数生长期细胞用于实验。按5×103个细胞/孔接种于96 孔板中，实验设5 个不同浓度（0、10、25、50和100 μmol/L）Vit B2组，每组设5个复孔。经不同浓度Vit B2处理24 h后，检测乳酸、葡萄糖、琥珀酸脱氢酶含量，严格按照试剂盒说明书操作。实验重复3次，取均值。

1.3.3 qPCR检测细胞调节糖酵解途径关键酶及葡萄糖转运体1（GLUT1）mRNA表达 药物处理24 h后收集细胞，PBS清洗 3 次。按 500 μL/孔加入 TRIzol 裂解细胞，提取细胞总RNA，逆转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA。应用SYBR Green 试剂进行 qPCR 检测，反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 10 s，59～62 ℃退火30 s，72 ℃延长30 s，共40 个循环；72 ℃延伸10 min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）、丙酮酸激酶M2（PKM2）和GLUT1mRNA 表达水平。实验重复3次，取均值。

Tab.1 The information of qPCR primers表1 qPCR引物序列

1.3.4 细胞增殖-毒性检测实验 取对数生长期细胞按5×103个/孔接种于96孔板中，待细胞融合度为80%～90%时，更换为含有不同药物的培养基，将细胞分为4 组，分别为对照组、Vit B2 组（加入50 μmol/L Vit B2）、阿帕替尼组（1 μmol/L阿帕替尼）和联合用药组（加入50 μmol/L Vit B2 和1 μmol/L阿帕替尼），每组设5个复孔。分别于0、12、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5%CO2培养箱温育1 h，采用酶标仪（EL-10C，Biobase 公司）于450 nm 波长处测定各组光密度（OD）值。实验重复3次，取均值。

1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡 药物处理24 h 后弃去培养液，预冷的PBS清洗细胞2次，加入适量胰酶消化细胞。吸除胰酶，加入预冷的PBS以重悬细胞，离心后弃去上清，加入500 μL 的1×结合缓冲液，制备单细胞悬液。分别加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，混匀后避光孵育 15 min。将离心管置于流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国BD Bioscience公司）中，检测细胞凋亡率。实验重复3次，取均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。计量资料以表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析。计数资料组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组与对照组血清Vit B2水平比较 胃癌组患者血清Vit B2 水平（207.85±39.71）μg/L 显著低于对照组（246.07±45.43）μg/L，差异有统计学意义（t=3.978，P＜0.05）。

2.2 血清Vit B2 与胃癌患者临床病理学指标的关系 血清Vit B2 水平与TNM 分期和分化程度有关（P＜0.05），而与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、吸烟史和饮酒史无关（P＞0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of serum vitamin B2 between the different clinicopathological characteristics表2 不同临床病理特征患者血液Vit B2水平比较（n=39）

2.3 不同浓度Vit B2组氧化磷酸化水平比较 除0 μmol/L 与10 μmol/L Vit B2 组间差异无统计学意义外，25、50、100 μmol/L Vit B2 组葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2组（均P＜0.05），琥珀酸脱氢酶含量均高于0 μmol/L Vit B2 组（均P＜0.05）；50 μmol/L Vit B2组葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，见表3。

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2组细胞氧化磷酸化指标的比较（n=5，）

Tab.3 Comparison of activities of mitochondrial respiratory chain complex between five groups表3 各Vit B2组细胞氧化磷酸化指标的比较（n=5，）

＊P＜0.05；a 与 0 μmol/L 组比较，b 与 10 μmol/L 组比较，c 与 25 μmol/L组比较，d与50 μmol/L组比较，P＜0.05

组别0 μmol/L组10 μmol/L组25 μmol/L组50 μmol/L组100 μmol/L组F葡萄糖消耗量（mmol/mg蛋白）10.17±0.84 9.86±0.71 8.74±0.78a 6.83±0.62abc 8.28±0.72abd 16.433＊乳酸生成量（mmol/mg蛋白）3.21±0.33 3.06±0.23 2.58±0.22a 2.22±0.24ab 2.78±0.32ad 10.414＊琥珀酸脱氢酶（U/mgprot）5.56±0.34 5.92±0.41 6.37±0.34a 7.53±0.44abc 6.82±0.46ab 18.516＊

2.4 不同浓度Vit B2 组细胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA水平比较 除0 μmol/L与10 μmol/L Vit B2组间差异无统计学意义外，25、50、100 μmol/L Vit B2组细胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于0 μmol/L Vit B2 组（均P＜0.05），且50 μmol/L Vit B2组GLUT1mRNA水平最低，见表4。

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2组细胞糖酵解mRNA相对表达量的比较（n=5，）

Tab.4 Comparison of relative mRNA expressions between five groups表4 各Vit B2组细胞糖酵解mRNA相对表达量的比较（n=5，）

＊P＜0.05；a 与 0 μmol/L 组比较，b 与 10 μmol/L 组比较，c 与 25 μmol/L组比较，d与50 μmol/L组比较，P＜0.05

组别0 μmol/L组10 μmol/L组25 μmol/L组50 μmol/L组100 μmol/L组F HKⅡ1.00±0.11 0.93±0.07 0.75±0.07ab 0.56±0.06abc 0.69±0.05ab 28.603＊PKM2 1.00±0.12 0.96±0.09 0.71±0.06ab 0.51±0.06abc 0.61±0.04ab 36.965＊GLUT1 1.00±0.10 0.89±0.05 0.66±0.07ab 0.43±0.04abc 0.59±0.05abd 61.558＊

2.5 各组细胞增殖活性比较 各组细胞增殖活性均随时间基本呈增高趋势。0 h 和12 h 时各组间差异无统计学意义；24、48 和72 h 时，对照组、Vit B2组、阿帕替尼组和联合用药组胃癌细胞增殖活性依次降低，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表5。

2.6 各组胃癌细胞凋亡率比较 对照组、Vit B2组、阿帕替尼组和联合用药组胃癌细胞凋亡率依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1、2。

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各组细胞增殖活性的比较 （n=5，OD值，）

Tab.5 Comparison of cell proliferation activities between four groups表5 各组细胞增殖活性的比较 （n=5，OD值，）

＊P＜0.05；F组间=93.270，F时间=335.300，F交互=14.590，均P＜0.05；组间比较：a与对照组比较，b与Vit B2组比较，c与阿帕替尼组比较，P＜0.05；组内比较：A与0 h比较，B与12 h比较，C与24 h比较，D与48 h比较，P＜0.05

组别对照组Vit B2组阿帕替尼组联合用药组F 0 h 0.33±0.03 0.35±0.03 0.31±0.03 0.31±0.03 2.037 12 h 0.42±0.04A 0.40±0.04 0.40±0.03A 0.39±0.03A 0.633 24 h 0.59±0.04AB 0.58±0.04aAB 0.55±0.04abAB 0.44±0.04abcA 15.213＊48 h 0.78±0.05ABC 0.71±0.05aABC 0.59±0.04abAB 0.48±0.04abcAB 42.765＊72 h 0.89±0.05ABCD 0.78±0.05aABC 0.68±0.04abABC 0.52±0.04abcABC 60.228＊F 160.512＊96.794＊82.086＊25.271＊

Fig.1 The apoptosis detected by flow cytometry图1 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

Fig.2 Comparison of apoptosis rate between four groups of cells图2 4组细胞凋亡率比较

3 讨论

哺乳动物肠道内的微生物可合成少量Vit B2，但机体所需的大部分Vit B2 仍需要从食物中获得。在体内，Vit B2 主要有黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸2 种形式，为细胞氧化磷酸化反应链中重要的辅因子，与细胞代谢和能量供应密切相关。流行病学研究显示，在食管癌高发地区，居民膳食Vit B2 摄入量显著低于正常水平，且通过补充Vit B2 可显著降低该地食管癌的发生率，提高患者的生存率［5］。此外，有研究指出，高Vit B2摄入可将胃癌的发病风险降低65%［12］。上述研究表明，Vit B2 具有潜在的抗肿瘤效应。但Vit B2在胃癌致病过程中的具体作用尚鲜见报道。本研究结果显示，胃癌患者血清Vit B2 水平显著低于对照组，且血清Vit B2 水平与胃癌患者的TNM 分期和分化程度相关，提示Vit B2可能在胃癌的致病过程中发挥重要作用。

正常细胞的能量供应主要以消耗葡萄糖进行有氧氧化磷酸化为主，这种方式效率高，几乎不产生乳酸。而肿瘤细胞则明显不同，主要以消耗葡萄糖进行糖酵解为主，同时产生大量的乳酸［13-14］。研究表明，肿瘤细胞糖酵解显著增强，而氧化磷酸化功能则明显降低［14-15］。HKⅡ和PKM2是肿瘤细胞的糖酵解代谢的主要限速酶，GLUT1 也是将葡萄糖转运入肿瘤细胞的关键酶［16-17］。琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化和线粒体呼吸链的枢纽之一，可作为评价氧化磷酸化的指标。研究表明，Vit B2 缺乏可以降低肝癌HepG2 细胞氧化磷酸化水平，通过加快葡萄糖消耗和产生大量乳酸，促进肝癌细胞的增殖活性［18］。本研究结果显示，25、50、100 μmol/L Vit B2 组葡萄糖消耗量和乳酸生成量均低于0 μmol/L Vit B2 组，琥珀酸脱氢酶含量均高于0 μmol/L Vit B2组；另外，25、50、100 μmol/L Vit B2 组细胞HKⅡ、PKM2和GLUT1mRNA 水平均低于 0 μmol/L Vit B2 组。提示补充Vit B2 可上调琥珀酸脱氢酶的活性，降低葡萄糖消耗量和乳酸生成量；且其作用机制可能与下调胃癌细胞HKⅡ、PKM2和GLUT1的表达水平有关。另外，50 μmol/L Vit B2组葡萄糖消耗量和乳酸生成量最低，且50 μmol/L Vit B2组GLUT1mRNA水平最低。故选择50 μmol/L 维生素这一浓度进行后续实验。

阿帕替尼通过抑制肿瘤血管生成，发挥抗肿瘤效应［10，19］。2014 年，阿帕替尼获得国家食品药品监督管理总局批准上市，主要用于晚期胃癌的治疗。但是，单一用药可提高机体产生抗药性的概率，削弱药物的疗效，而合理的联合用药可以提高抗肿瘤的疗效或减轻不良反应。目前临床已将阿帕替尼与其他药物联合应用，并得到较好的治疗效果［10-11，20］。本研究结果表明，单独使用Vit B2 虽可抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞凋亡，但效果不及阿帕替尼。此外，Vit B2 和阿帕替尼联合应用可显著抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡，其抗肿瘤效果优于单独使用Vit B2或阿帕替尼。

综上所述，胃癌患者血Vit B2水平降低，且与胃癌的TNM 分期和分化程度密切相关；Vit B2 与阿帕替尼联合用药可提高其对胃癌的抗肿瘤效果。