HPLC加校正因子的主成分自身对照法同时测定匹多莫德原料药中4种有关物质

郝桂明，王玉霞，王 卫，唐素芳

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

匹多莫德（pidotimod）是一种化学合成的免疫调节剂，结构类似于二肽，是一种具有口服生物活性的免疫促进剂，具有抗病毒、抗感染、抗氧化性及抗刺激性等特点，既能促进特异性免疫反应，又能促进非特异性反应，从而发挥显著的抗菌和抗病毒作用［1］。临床上主要用于免疫功能低下患者急慢性感染和反复发作感染的治疗，如用于反复呼吸道感染、耳鼻喉感染的治疗等，同时也可作为急性感染时抗菌药物治疗的辅助用药［2］。匹多莫德目前在国内外药典中均未收载，在新药转正标准[3]中也未对其特异性杂质进行测定的方法。笔者采用HPLC加校正因子的主成分自身对照法对匹多莫德原料药中的4种有关物质同时进行测定，可有效地检测其特定杂质（基本信息见表1），方法灵敏、准确，结果可靠。

表1 匹多莫德原料药有关物质基本信息

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，包括二极管阵列紫外检测器、Open-lab CDS色谱工作站；METTLER XS205电子天平；Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。

1.2 试药剂 匹多莫德原料（批号Z140907、Z140908、Z150102）；L-噻唑烷-4-羧酸对照品由EUTICAL S.p.A公司提供（批号 08/0701，纯度：99.5%）；L-焦谷氨酸对照品由EUTICAL S.p.A公司提供（批号1371943，纯度：100.1%）；杂质Ⅰ对照品由TorontoResearch Chemicals公司提供（批号4-YKZ-93-1，纯度：98%）；杂质Ⅱ对照品由Toronto Research Chemicals公司提供（批号1-AJK-66-1，纯度：98%）；匹多莫德为中检院对照品（批号100588-201402，纯度：99.9%）。甲醇和异丙醇均为色谱纯（天津市康科德科技有限公司），磷酸二氢钠为分析纯（阿拉丁化学试剂），水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent 1260高效液相色谱仪，Kromasil 100-5-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钠溶液（磷酸调节pH值至 2.50 ± 0.05）-甲醇-异丙醇（97∶2∶1），流速为1.0 ml/min；检测波长为 210 nm，柱温：25 ℃，进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 精密称取匹多莫德原料25 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ和匹多莫德对照品各10 mg，置20 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液，精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 杂质对照品溶液 精密称取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ对照品各10 mg，分别置同一100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验 精密称取L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ和杂质Ⅱ对照品各10 mg，分别置同一20 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品贮备液。精密称取匹多莫德原料药50 mg，置100 ml量瓶中，加流动相适量使溶解，精密加入杂质对照品贮备液1 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液，精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。理论板数按匹多莫德峰计算不低于3 000，匹多莫德峰与相邻杂质峰之间的分离度应符合要求。见图1。

图1 系统适用性试验HPLC图

2.4 专属性试验

2.4.1 空白溶剂 精密量取溶剂10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。空白溶剂无干扰。

2.4.2 酸破坏试验 取匹多莫德原料约10 mg，置20 ml量瓶中，加4 mol/L盐酸溶液2 ml溶解后，室温放置4 h，用4 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.3 碱破坏试验 取本品约10 mg，置20 ml量瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，室温放置3 h，用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至中性，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.4 氧化破坏试验 取本品约10 mg，置20 ml量瓶中，加流动相约5 ml使溶解后，加3%过氧化氢溶液1 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，室温放置2 h。精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.5 高温破坏试验 取本品约10 mg，置20 ml量瓶中，加适量流动相溶解，水浴加热4 h，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.4.6 光照破坏试验 取本品约10 mg，置20 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。日光下放置2周。精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果表明，匹多莫德原料药经酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏和光照破坏后，各杂质峰之间及与主成分峰均能完全分离。见图2。

图2 空白溶剂（A）酸破坏（B）碱破坏（C）氧化破坏（D）高温破坏（E）光照破坏（F）高效液相色谱图

2.5 线性关系考查 精密量取“2.2.2”项下对照品储备液适量，用流动相逐步稀释使成梯度浓度，分别精密量取10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标（X），以相对应的峰面积为纵坐标（Y），分别进行线性回归，并以方程斜率（K）计算校正因子，匹多莫德及各杂质的回归方程和校正因子见表2。

表2 匹多莫德及各杂质的回归方程和校正因子

2.6 定量限和检测限考查 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液适量，采取逐步稀释法测定，记录色谱图。以信噪比（S/N）为 10∶1计算定量限，以信噪比（S/N）为3∶1计算检测限。L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ和匹多莫德的定量限分别为3.0、2.4、1.7、5.0和0.8 ng，检测限分别为 0.9、0.6、0.6、2.0 和 0.3 ng。

2.7 精密度试验 取“2.2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ、杂质Ⅱ和匹多莫德峰面积的 RSD分别为 0.3%、0.7%、1.3%、0.3%和0.2%，表明色谱系统精密度良好。

2.8 稳定性试验 取“2.2.1”项下的供试品溶液，分别于室温条件下放置0、4、8、12和24 h后取样测定，记录色谱图。结果表明，随着放置时间延长，L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ均有增长的趋势，其中杂质Ⅰ显著增长。故供试品溶液须临用新制。

2.9 重复性试验 按“2.2.1”项下的方法制备供试品溶液共6份，按“2.1”项下色谱条件进样测定，L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅱ均未检出，杂质Ⅰ峰面积的RSD为0.89%，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取已知各杂质含量的匹多莫德原料药（批号Z140907）50 mg，共6份，分别置100 ml量瓶中，加流动相适量使溶解，分别精密加入“2.2.3”项下杂质对照品溶液1 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果L-噻唑烷-4-羧酸平均回收率为100.1%，RSD为1.6%；L-焦谷氨酸平均回收率为101.0%，RSD为0.8%；杂质Ⅰ平均回收率为99.4%，RSD为0.9%；杂质Ⅱ平均回收率为101.4%，RSD为1.7%。见表3-表6。

表3 L-噻唑烷-4-羧酸加样回收率试验结果（n=6）

表4 L-焦谷氨酸加样回收率试验结果（n=6）

表5 杂质Ⅰ加样回收率试验结果（n=6）

表6 杂质Ⅱ加样回收率试验结果（n=6）

2.11 样品中有关物质测定 取匹多莫德原料药3批，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，并按加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质的含量。经对3批样品测定，结果见表7。

表7 匹多莫德原料药中有关物质测定结果

3 讨论

3.1 色谱柱品牌的选择 笔者在前期试验中选择较常用的 phenomenex Luna C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Agilent C18（250 nm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分别测定样品，匹多莫德峰与相邻杂质峰分离度均小于1.5，不符合《中国药典》要求。而采用Kromasil 100-5-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm)色谱柱测定样品时，匹多莫德峰与相邻杂质峰分离度大于2.0，满足系统适用性试验的要求。

3.2 流动相pH值的影响 在流动相的筛选优化时发现，流动相的pH值对匹多莫德与各杂质的分离度影响很大。当pH值＜2.45时，L-噻唑烷-4-羧酸与相邻溶剂峰分离度欠佳；当pH值＞2.55时，匹多莫德峰与相邻杂质峰不能完全分离。因此，试验应严格控制流动相pH值在2.50±0.05的范围内。

3.3 各杂质限度的拟定 根据ICH指导原则，结合现行国家标准的杂质限度，拟定匹多莫德的杂质限度为：L-噻唑烷-4-羧酸、L-焦谷氨酸、杂质Ⅰ和杂质Ⅱ均不得过0.2%，杂质总量不得过0.5%。

综上所述，采用笔者建立的HPLC-加校正因子的主成分自身对照法测定匹多莫德原料药中的4种有关物质灵敏、准确、可靠，可有效控制匹多莫德原料药的质量。