胶束电动毛细管色谱法分析玫瑰纯露中的苯乙醇

王伟峰, 张 瑛,2, 杨军丽*

(1. 中国科学院兰州化学物理研究所, 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室, 甘肃省天然药物重点实验室, 甘肃 兰州 730000; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

玫瑰(Rosarugosa)是蔷薇目、蔷薇科、蔷薇属、落叶直立灌木。玫瑰花别名徘徊花、刺玫花,其性甘微苦,温,无毒,入肝脾二经,广泛地应用于人们的日常保健中,在我国多个省份有食用玫瑰制品的习俗。明朝药物典籍《食物本草》就有玫瑰入药的记录“主利肺脾、益肝胆,食之芳香甘美,令人神爽”。玫瑰花含挥发油、氨基酸、多酚、黄酮等多种化学成分,具有保护心血管[1,2]、抗细菌及病毒[3]、抗氧化[4]等生物活性。我国栽种的玫瑰品种主要有:甘肃苦水玫瑰、山东平阴玫瑰、大马士革玫瑰及百叶玫瑰等。目前,玫瑰已发展为一种集观赏、香料、食用、酿酒及药用等多种用途于一身的植物资源。

玫瑰纯露是玫瑰提取精油后的重要副产物,是玫瑰精油的饱和水溶液,不仅含有植物水溶活性成分,同时也保留精油的芳香成分,且含有矿物养分,具有抗衰老、清除自由基[5,6],抗过敏、抗菌、消炎、防紫外线损伤等功效[7,8]。目前,国内外对玫瑰精油有着严格的质量控制标准[9,10],但对于玫瑰纯露的质量则无相关标准。

毛细管电泳(CE)技术因其分离效率高、分析速度快、样品量消耗少等优点,已发展成为分离科学领域最重要的分析技术之一。胶束电动毛细管色谱(MEKC)于1984年由Terabe等[11]建立,是依据表面活性剂形成胶束做为准固定相,根据溶质在胶束相和水溶液相间分配差异获得对分析物的分离,其对非极性分子、弱极性分子、强极性分子具有良好的兼容性,极大地拓展了CE的应用范围[12-17]。特别地,在以长链脂肪酸及其钠盐为表面活性剂的胶束电动毛细管色谱对弱极性有机分子分离过程中呈现出类反相色谱洗脱次序的特征,使得MEKC在药物分离分析研究中获得广泛应用[18-23]。文献中关于玫瑰制品中香气成分苯乙醇类弱极性分子的CE分离分析研究鲜有报道[24],未见直接利用MEKC法进行玫瑰精油或玫瑰纯露样品分析的文献。

本文旨在发展一种简单、灵敏、稳定的CE方法用于玫瑰纯露样品中苯乙醇含量的测定。本方法中选择表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)作为添加剂,硼砂为背景电解质,建立了一种MEKC法,可实现玫瑰纯露中苯乙醇的快速、灵敏检测。该方法有望应用于玫瑰纯露中苯乙醇的检测,为玫瑰纯露的质量控制提供了一种简单、快速、灵敏的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7100毛细管电泳仪配有二极管阵列(photo-diode array, PDA, 190～600 nm)检测器(安捷伦科技公司),熔融石英毛细管(48.5 cm×50 μm,河北永年锐沣色谱器件有限公司)有效长度40 cm。PB-10 pH酸度计(赛多利斯,德国)。氢氧化钠、硼砂、SDS、氯化钠、盐酸、甲醇均为分析纯,购自百灵威公司。苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、香茅醇均为分析纯,购自上海国药集团。玫瑰购自当地市场并按照水蒸气蒸馏提取及分液器分流制备玫瑰纯露,蒸馏装置由实验室自行组装。其他试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水(18.25 MΩ·cm),由莱科超纯水系统制备(上海,莱科)。

1.2 缓冲溶液和样品的配制

CE运行的缓冲溶液由10 mmol/L的硼砂和15 mmol/L的SDS组成(pH=9.3)。精密称取苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇和香茅醇,用分析纯甲醇配制成标准储备液,质量浓度为1 g/L,常温保存,使用时直接用超纯水准确稀释使用;玫瑰纯露样品使用前均存放于4 ℃冰箱,经CE分析时直接取出过滤使用。所有缓冲溶液使用前均用0.45 μm的醋酸纤维滤膜过滤两次。

1.3 CE分离检测条件

新毛细管首次使用前分别用甲醇、1 mol/L的氢氧化钠、超纯水冲洗10 min、60 min、30 min;每次使用前用0.5 mol/L的氢氧化钠、超纯水和运行缓冲溶液依次冲洗2 min、2 min、3 min;两次运行过程之间用缓冲溶液平衡冲洗毛细管5 min。进样条件:5 kPa, 5 s。分离电压为+20 kV;毛细管温度为20 ℃;采用PDA检测,检测波长为208 nm。

2 结果与讨论

玫瑰纯露为玫瑰精油的饱和水溶液,苯乙醇为其指标成分,还含有苯甲醇、芳樟醇、香茅醇、氨基酸、黄酮、酚酸、矿物质、无机盐等[25]。开展玫瑰纯露及制品的质量控制,要求对它们进行有效的分离分析。考虑到CE运行模式众多,需要兼顾到微溶性和可溶性物质,初步实验发现常规毛细管区带电泳法并不能满足要求,MEKC法成为优选模式。同时,考虑到玫瑰纯露样品中化合物类型复杂多样,接下来的实验主要围绕影响MEKC法分离度、灵敏度、稳定性等的多个因素展开考察。

2.1 胶束对分离的影响

在MEKC法分析时,通常采用的胶束分子有阳离子、阴离子和中性分子表面活性剂。玫瑰纯露样品中分析物主要为羧酸、多酚、萜类物质,结合实验室前期研究经验,阴离子表面活性剂更适合它们的分离分析。研究表明,SDS具有较好的分离性能。实验中考察了SDS浓度对分离的影响。如图1所示,表面活性剂浓度较低时对样品的分离具有一定的改善作用,随着其浓度的升高分离度明显改善,当SDS浓度达到15 mmol/L时样品中各峰获得良好分离。继续增加SDS浓度,出峰时间较晚的几个分析物出现明显的峰展宽现象,这可能是由于胶束浓度过大导致分析物解离困难。综合考虑,确定15 mmol/L为SDS的最佳浓度。

图 1 SDS浓度对分离的影响Fig. 1 Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) concentration on the separation Capillary length, 48.5 cm; effective capillary length, 40 cm; sample injection, 5 kPa, 5 s; capillary temperature, 20 ℃; detection wavelength, 208 nm; separation voltage,+20 kV. Peak identification: 1. benzyl alcohol; 2. phenethyl alcohol; 3. linalool; 4. citronellol.

2.2 背景电解质浓度的优化

实验中考察了背景电解质溶液中硼砂浓度对分离的影响,如图2所示,5 mmol/L硼砂条件下样品中各分析物峰可以清晰辨认。硼砂对分析物从SDS胶束团的解离有辅助作用,硼砂浓度的升高有利于芳樟醇和香茅醇从SDS胶束团中解离,它们的峰形变尖峰亦变高;持续增加硼砂浓度,SDS的临界胶束浓度逐渐下降,SDS胶束团对芳樟醇和香茅醇的助溶能力下降,引起吸附增强解离变弱,从而出现峰高迅速降低的情况。通过对比发现,硼砂浓度为10 mmol/L时样品中各分析物可以获得良好分离且检测灵敏度最高。

图 2 硼砂浓度对分离的影响Fig. 2 Effect of sodium borate concentration on the separation SDS concentration: 15 mmol/L. Other conditions were the same as in Fig. 1.

2.3 检测波长、进样条件及分离电压影响

实验对检测条件进行了优化,分别选择208、214、254、280 nm进行了考察。结果表明样品中大多数分析物的紫外吸收较弱,在208 nm和214 nm处获得较高的检测灵敏度和平稳的基线。经过进一步比较发现,208 nm作为检测波长可获得更优的检测信噪比。

实验还对进样条件进行了优化,分别采用电动进样(-10 kV, 5 s)、压力进样(5 kPa, 5 s)、混合进样(-10 kV, 3 s; 5 kPa, 2 s)等模式。结果发现,压力进样具有更好的稳定性,尽管其分析的灵敏度较单独电动进样和混合进样较差。考虑到该方法作为质量控制标准方法进一步推广应用的需要,选择压力进样为样品引入方式。

表 1 本文方法与文献方法的比较

分离电压直接影响样品中各组分的迁移时间和分离效果。在分离电压为+15、+20、+25、+30 kV条件下对分离分析效果进行了考察。结果表明,随着分离电压的升高,各分析物迁移时间明显缩短,分离度影响并不显著,但运行电流迅速增加,在+30 kV时出现“断流”现象。综合考虑分析速度、分离度、稳定性等因素,确定+20 kV为本实验的分离电压。

2.4 方法学评价

图 3 优化条件下苯乙醇标准品的重现性考察Fig. 3 Investigation of the repeatability of a standard sample under the optimum conditions Sodium borate concentration: 10 mmol/L; SDS concentration: 15 mmol/L. Other conditions were the same as in Fig. 1.

在实验优化条件下,考察了该方法的精密度、线性范围、检出限和定量限。以苯乙醇为标准样品,重复运行6次进行精密度的考察。如图3所示,经6次平行运行可以发现该方法具有非常好的稳定性。进一步通过日内、日间测试对其重现性进行了考察,分离时间、峰面积、峰高的相对标准偏差(RSD)分别为日内(intra-day): 0.05%、1.10%、0.67%,日间(inter-day): 0.06%、1.40%、1.43%,表明该方法具有很好的稳定性。对苯乙醇的质量浓度(x, mg/L)与电泳图中峰面积(y)进行线性拟合,方程为y=1.36+0.55x,线性相关系数(r2)=0.999 0,苯乙醇的线性范围为0.50～1 000 mg/L,基于3倍和10倍的信噪比(S/N)计算得到该方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.091 mg/L和0.35 mg/L。分别将本方法与文献方法比较(见表1),结果表明本工作建立的MEKC方法分析时间较文献方法明显缩短,且检测灵敏度较文献方法提高30倍以上[24],为玫瑰纯露样品的质量控制提供了一种有效的方法,具有实际应用价值。

2.5 实际样品测定

在优化的实验条件下,采用本方法对玫瑰纯露实际样品进行了分析,采用迁移时间比对和分析物紫外吸收光谱图对电泳图中各峰进行确认(见图4)。从图4a可以清晰地看出,苯乙醇(峰2)与样品中其他组分分离良好。在10、100、500 mg/L水平下进行了加标回收试验,每个水平进行3次平行测定,其回收率分别为98.1%(RSD, 2.8%)、95.3% (RSD, 2.4%)、102.7% (RSD, 2.6%),证明该方法准确性良好。

对实际样品进行了电泳分析(见图5),迁移时间稳定、峰形尖锐,表明该方法抗基质干扰能力强,稳定性佳。将本方法应用于48个玫瑰纯露样品的分析(见表2),由表中数据可以发现各样品中苯乙醇含量分布于0.17～4.52 mg/L之间,浓度水平存在较大差异,其主要原因为各组样品玫瑰鲜花存放时间及存放条件不同(a组室温下7天,b组4 ℃下1天,c组-20 ℃下1天)。这说明该法在玫瑰纯露质量控制方面具有潜在的应用价值。

图 4 优化条件下(a)苯乙醇标准样品及实际样品的电泳图及(b)苯乙醇的紫外吸收光谱图Fig. 4 Electropherograms of (a) a standard sample and a real sample, and (b) UV-Vis spectrum of phenylethyl alcoholConditions were the same as in Fig. 3.

表 2 玫瑰纯露中苯乙醇含量测试结果(n=3)

图 5 优化条件下玫瑰纯露样品的电泳图Fig. 5 Electropherograms of rose dew samples under the optimum conditionsConditions were the same as in Fig. 3.

3 结论

本文建立了一种用于玫瑰纯露中苯乙醇检测的MEKC方法。对影响实验的各因素进行了详细考察,在优化条件下,7 min内可以完成玫瑰纯露样品的高效分析,提高了分析速度、降低了分析成本。本方法在实际样品分析中展现出良好的抗基质干扰能力、稳定性和灵敏性,为玫瑰纯露及其制品的质量控制研究提供了技术支撑。