基于电驱动在线快速分离富集技术的研究进展

刘玉兰, 陈雅莉, 肖小华, 夏 凌, 李攻科

(中山大学化学学院, 广东 广州 510275)

样品前处理是复杂样品分析的关键步骤,根据物质的理化性质差异,将待测物从复杂的基质中预先分离富集出来,帮助提高分析方法的灵敏度、选择性和准确性。但这是一个无法自发进行的、从无序到有序熵减的过程。实现样品的有效制备需要向体系做功或通过引入相、膜和场改变化学势的分布以降低体系的熵值[1,2]。这些过程不仅耗时费力,还极易引起误差,是当前分析化学发展的瓶颈问题。将电场引入在线样品前处理,既能向体系做功,又能驱动样品在分离、富集、检测各步骤之间定向迁移,使熵减过程顺利进行,是快速样品制备的有效途径[3,4]。

图 1 近10年关于电驱动在线快速分离富集技术的文献报道情况Fig. 1 Literature reports on electrically-driven force based online rapid separation and enrichment techniques in recent 10 years Literature source: Web of Science; keywords (2010-2020): capillary electrophoresis (CE), microchip electrophoresis (MCE), online concentration, solid-phase (micro)extraction, liquid-phase (micro)extraction, electromembrane extraction (EME).

近年来,电驱动毛细管在线分离富集、电驱动芯片在线分离富集、电驱动膜萃取等模式的电驱动在线快速样品前处理技术发展迅速。该技术综合了多种加速样品制备的策略:(1)以电场形式向系统输入能量,加速系统的传质和传热;(2)以电渗、电泳定向流形式驱动样品在分离、富集、检测各步骤之间定向迁移,保证样品前处理/检测顺利进行;(3)利用在线联用技术集成样品前处理与分析步骤,以提高自动化程度和减少人为误差;(4)通过微型化装置或微萃取方法提高样品制备效率，缩短样品制备时间。图1总结了近10年来基于电驱动的在线快速分离富集技术的文献报道情况,该研究领域每年都有超过100篇的研究论文,其中半数以上的文献是基于电驱动毛细管在线分离富集方法,电驱动膜萃取在线分离富集技术研究的文献虽然较少,但呈现逐年递增的趋势,正逐渐成为研究热点。本文综述了包括电驱动毛细管分离富集、电驱动芯片分离富集和电驱动膜萃取3种在线模式的电驱动在线分离富集技术的研究进展,讨论了该技术的能量输入、定向流加速传质、集成策略和微型化等加速样品制备原理,展望了电驱动在线快速分离富集技术的发展与应用趋势。

1 电驱动毛细管在线快速分离富集技术

根据带电粒子在电场作用下在介质中定向迁移的性质,通过在毛细管两端施加高压电场实现的毛细管电驱动技术不仅是快速、高效、低耗的分离手段,同时也是复杂样品快速制备的有效途径。电泳分离之前在同一毛细管中先进行样品的电场聚焦,在线毛细管电泳分离技术利用电渗驱动和电泳驱动对样品进行预分离富集,能提高电泳分离效率和检测灵敏度,且操作简便、速度[5,6]。而利用在线联用技术将微萃取与毛细管电泳进行集成,通过电驱动实现样品中目标物在样品制备与分析检测各步骤之间的定向迁移,则在保持自动化样品分析省时省力优势的基础上进一步拓展了毛细管电泳技术在复杂样品分离分析的应用范围。

1.1 在线毛细管电泳分离富集技术

在毛细管两端施加电场,管中的溶液受电渗驱动进行定向移动,移动速度与溶液理化性质密切相关。通过调控样品溶液和电泳背景溶液的离子浓度,可重新分配毛细管中的区域电场强度,改变样品与带电粒子的迁移速度乃至方向，以达到目标物分离富集的效果[7,8]。另外,基于待测目标物在不同电泳背景溶液中淌度、解离度等的性质差异也可进行电驱动样品预富集[9,10]。这些电场聚焦技术可与电泳分离在同一毛细管中完成,实现在线样品前处理与电泳分析的联用,无须附加样品前处理装置,操作简便[11,12]。根据操作方法和富集效果可细分为简单电场聚焦、增强电场聚焦、整管聚焦、等速电泳聚焦和pH聚焦在线毛细管电泳分离富集技术。

图 2 简单电场聚焦-CE在线分离富集技术示意图Fig. 2 Schematic diagram of simple electric fields stacking-CE online separation and enrichment technique

简单电场聚焦-CE在线分离富集技术中,低离子浓度的样品以电动进样模式引入毛细管中高离子浓度的电泳背景溶液,样品区带上的电场强度大于电泳背景溶液,目标分析物可在进样口处富集,形成简单电场聚焦(见图2)。Zayed和Belal等[11]建立了简单电场聚焦-CE方法用于茚达特罗和葡萄糖吡喀两种药物的同时测定。他们将低离子浓度的样品甲醇-水(70∶30, v/v)溶液以电动进样模式引入充满65 mmol/L磷酸盐缓冲液的毛细管中,进样电压10 kV,进样时间20 s,使目标物富集于样品溶液与缓冲液交界面。该方法有效提高了茚达特罗和葡萄糖吡喀的检测灵敏度,并成功应用于血浆和尿液中2种药物的测定。简单电场聚焦-CE在线分离富集技术还在天然产物研究[13,14]、食品安全[15]、药物监测[16]中得到应用。

增强电场聚焦-CE在线分离富集技术是在简单电场聚焦操作之前,以压力进样模式先进一段纯溶剂区带,再以电动进样模式引入样品溶液,此时纯溶剂区带上电场强度远大于毛细管中其他区域,引起目标分析物的增强电场聚焦。由于溶剂区带长度可控,目标物的富集效果也得到相应提升。Hamidi等[17]用增强电场聚焦-CE在线分离富集技术实现了呼出液中美沙酮的手性分离与测定。所有样品进样前先在毛细管中注入一段水区带,再以电动进样模式引入样品溶液,进样电压15 kV,进样时间40 s。增强电场聚焦-CE在线分离富集技术也用于单个神经元细胞内代谢物检测,灵敏度提高了100～300倍[18]。在尿样中卡西酮对映体的检测中,灵敏度提高了444～472倍[19],在磺胺类药物快速分析中,其富集倍数高达150～206倍[20]。

为提高痕量目标物的富集倍数,整管聚焦-CE在线分离富集技术先将样品溶液灌满整根毛细管,再施加反向分离电压,使电泳背景溶液从毛细管出口处倒灌进入,在样品/背景溶液界面形成电场强度梯度,并持续富集目标物直至背景溶液到达进样口。Chen等[21]运用整管聚焦-CE在线分离富集技术进行细胞中铜离子分析,他们先将样品溶液充满毛细管,然后施加与分离过程相反的高压,将样品基质推出毛细管,当背景溶液完全填充毛细管时,又将电源极性改变,使分离条件回到正常的分析。与常规毛细管区带电泳分析相比,该技术样品富集倍数高达1 000倍。整管聚焦-CE在线分离富集技术在药物质量控制[22,23]、天然产物研究[24]、环境监测[25]中的应用优势明显。

pH聚焦-CE在线分离富集技术通过调节样品溶液与电泳背景溶液的pH值,弱解离样品在通过pH突变界面时因解离度变化而改变迁移速度,形成样品聚焦。Li等[29]利用该技术成功分离富集血液中的肌红蛋白。pH聚焦-CE在线分离富集技术还可用于弱碱性/弱酸性或两性离子[30,31],如肽[32]和氨基酸[33]的分析。

将两种或两种以上的电场聚焦技术结合,采用协同电场聚焦或多步电场聚焦的方法提高富集倍数已成为一种趋势。结合增强电场聚焦和整管聚焦2种电场聚焦技术,Hsieh等[34]采用增强电场聚焦-整管聚焦-CE在线分离富集技术分析动物饲料中8种激素,与常规电泳技术相比,灵敏度提高了400～2 000倍。Kawai等[35]发展了简单电场聚焦-增强电场聚焦-CE在线分离富集技术,在葡萄糖低聚物分析中,该方法灵敏度提升高达5个数量级。

1.2 微萃取-毛细管电泳在线联用分离富集技术

基于电场聚焦作用的毛细管电泳在线分离富集技术虽然具备装置简单、操作简便的优势,但在复杂样品分析中容易受到基体干扰,且富集效果受到进样体积或毛细管长度的限制[36,37]。毛细管中实现微萃取-电泳在线联用技术在复杂样品分离富集中优势明显。该技术主要包括液相微萃取-毛细管电泳及微固相萃取-毛细管电泳在线联用分离富集技术。

液相微萃取-毛细管电泳在线联用分离富集技术中液相微萃取常以液膜萃取形式进行。操作过程与增强电场聚焦相似,先以压力进样模式向毛细管引入萃取液膜区带,再以电动进样模式引入样品溶液,样品溶液中目标分析物在电驱动下穿过萃取液膜区带富集于液膜/缓冲液界面。该技术中萃取液膜不仅起到消除样品基质干扰的作用,还引起目标分析物的电场聚焦。Chui等[38]采用自由液膜萃取-毛细管电泳在线联用技术测定污染河水样品中百草枯和地喹,与常规CE分析相比,在线分离富集技术灵敏度提高了1 500～1 866倍,且不再需要附加离线样品前处理步骤。

图 3 微固相萃取-毛细管电泳在线联用方式Fig. 3 Online integrated micro solid-phase extraction-capillary electrophoresis methods

在电驱动下,微固相萃取(μ-SPE)与毛细管电泳也可实现在线联用。如图3所示,在电泳毛细管上利用微固相萃取涂层或整体柱的形式对进样端修饰,或直接将固相萃取小柱拼接到进样口,微固相萃取和电泳可在同一根毛细管上进行[39]。Zhang等[40]采用μ-SPE整体柱方式修饰电泳毛细管进样口,并在修饰后的毛细管中进行牛血清白蛋白、非洲爪蟾卵和大肠杆菌中多肽的在线微固相萃取-毛细管区带电泳-质谱分析。Pero-Gascon等[41]报道了一种在线适配体固相萃取-毛细管电泳-质谱技术用于血液中α-核蛋白的分离富集。适配体固相萃取小柱以拼接方式接入电泳毛细管,红细胞裂解液样品在电驱动下进入毛细管前端的适配体固相萃取小柱,目标物预分离富集后,再进行电泳与质谱分析。该方法线性在0.5～10 μg/mL之间,LOD为0.2 μg/mL,可用于分析帕金森病患者红细胞裂解液中内源性α-核蛋白。

在一根毛细管上实施的微固相萃取-毛细管电泳在线联用分离富集虽然在复杂样品分析中有一定的优势。但是,在SPE过程中样品基质也会通过分离毛细管导致分离通道污染,影响分离效果。在独立的两根毛细管中分别进行固相萃取和电泳,并以泵、阀和流体控制实现在线联用，可避免样品基质对分离通道的污染,且能进一步增大样品处理量。Zhang等[42]采用四通纳米阀作为接口,实现μ-SPE-CE在线联用,并应用于废水中磺胺类抗生素的分析。该方法每次进样可对20 mL样品进行在线分离富集,与常规CE相比,LOD降低了约20倍。

2 电驱动芯片在线快速分离富集技术

样品前处理时长与待处理样品量和处理效率直接相关。利用微加机械加工与微流控技术实现的样品前处理微型化,不仅可处理微量样品,还能在微通道中迅速完成传质和传热过程,加速样品制备[43,44]。通过微流控芯片加工过程中定制的通道网络设计和流体操控技术,在一块芯片上完成萃取、分离、富集、纯化、检测等多个样品前处理和分析步骤[45,46]。而电驱动流体控制技术因其高效、灵活、清洁等优势从众多微流体操控技术中脱颖而出。在电驱动芯片在线分离富集技术中,电泳驱动力可实现目标物的电泳分离,电渗驱动力既可作为芯片上不同单元之间流体输送动力,也可用于电动流体泵阀的操控[10,47]。该在线联用技术主要包括在线芯片电泳分离富集技术和微萃取-芯片电泳在线联用分离富集技术。

2.1 在线芯片电泳分离富集技术

芯片电泳是微型化的毛细管电泳,所以毛细管电泳在线分离富集方法能在芯片上实施。而芯片通道的加工方式,使分离通道截面积更小,尺寸更均一,加快传质平衡的同时减少焦耳热的产生,提升电泳分离性能[48,49]。在分离微通道入口处设计进样阀,芯片电泳的自动进样极易实现。芯片电泳的电场聚焦技术自动化程度更高,速度更快,而芯片装置的便携性使其在现场快速检测中展现出良好的应用潜力[50,51]。

Zeid等[52]报道了一种在十字芯片通道上实现的简单电场聚焦-芯片电泳在线联用技术。该技术先将样品溶于低离子浓度缓冲液(3 mmol/L硼酸盐缓冲液)中,以高离子浓度缓冲液(30 mmol/L硼酸盐缓冲液)为电泳背景溶液,电动进样过程中目标分析物巴喷丁(GPN)和普瑞巴林(PGN)被富集于样品区带前端。该方法对PGN和GPN芯片电泳检测灵敏度分别提高了14倍和17倍,整个分离富集检测可在4 min内完成。Cheng等[53]利用增强场聚焦-芯片电泳在线分离富集技术,并于电感耦合等离子体质谱检测联用测定面包中溴的形态。该技术可在35 s内实现溴酸盐和溴酸盐的分离,且溴酸盐和溴酸盐的灵敏度分别提高了12.8倍和12.0倍。Zhang等[54]报道了增强场聚焦-芯片电泳在线分离富集技术在大肠杆菌检测中的应用。Kitagawa等[55]报道了整管聚焦-芯片电泳在线分离富集技术,首先使用注射器将样品溶液手动注入整个通道,再利用反向电泳驱动力使样品迁移回进样口并富集于狭小区带中,随后,该技术被应用于DNA片段的预富集和芯片电泳分离。Kawal等[56]利用整管聚焦-芯片电泳在线分离富集技术将低聚葡萄糖芯片电泳检测灵敏度提高了3个数量级以上。在芯片上等速电泳聚焦的灵敏度和效率与CE相比较低,但是它的装置简单,操作更加灵活[57]。Eid等[58]用等速电泳聚焦-芯片电泳在线联用分离富集技术分析全血样本中失活的单核增生李斯特菌,包括细胞裂解、萃取、检测等步骤在内的整个分析过程仅需50 min,且可通过芯片设计加工多通道芯片,实现多个样品的同时分析检测。

多种电场聚焦-芯片电泳在线联用技术的集成,可将不同聚焦技术的优点相互结合,使目标物的灵敏度得到提高。Kitagawa等[59]采用简单电场聚焦-增强电场聚焦-芯片电泳在线分离富集技术,研究了微芯片电泳,并实现了高灵敏度的分析。该方法将染料的分析灵敏度提高了4 520倍,是单一增强电场聚焦-芯片电泳分析灵敏度的33倍。Wang等[60]将整管聚焦-多步增强电场聚焦-芯片电泳技术运用于大肠杆菌的分析,该电驱动多重富集策略的富集倍数高达6 000倍,且操作简单,样品消耗量少。

2.2 微萃取-芯片电泳在线联用分离富集技术

在芯片上构建微型化样品前处理单元,微萃取与电泳的在线联用可通过芯片通道中的流体操控技术实现,而样品前处理装置的微型化,可进一步加速分离富集过程。目前芯片与微流控技术已实现了液-液萃取[61,62]、电膜萃取[63]、固相萃取[64]、液相微萃取[65]等前处理步骤与芯片电泳的在线联用,在食品安全[66]、环境监测[67]、医疗诊断[68]等快速检测中得到应用。

将芯片液膜萃取与毛细管电泳在线联用,Ramos Payán等[69]利用电驱动流协助接受液相向毛细管的转移,实现了阿米替林、美沙酮、氟哌啶醇、洛哌丁胺、哌替啶等药物的在线分离富集。液膜萃取芯片由样品通道、接受液通道和支撑液膜组成,萃取过程以压力流为主要驱动力,接受液在电驱动力协助下进入毛细管进行后续在线分析。该技术的萃取效率和富集倍数都较之前的文献报道高[70]。以阿米替林为例,120 min的连续萃取可实现500倍的富集。

将分子印迹固相萃取整体毛细管柱接入电泳芯片,Zhai等[71]的微固相萃取-芯片电泳在线联用装置可在电场驱动下依次进行样品的提取、注射、分离和检测。该方法避免了在微通道中制备固相萃取柱的烦琐步骤,也可针对目标分析物更换整体柱,拓展装置的应用范围。Cakal等[64]在芯片上进行硅烷化处理后进行修饰,用SPE-CE在线联用装置对儿茶酚胺进行富集、洗脱和检测,该方法可实现100倍的富集。

3 电驱动膜萃取在线分离富集技术

2006年,Pedersen-Bjergaard等[72]报道了一种基于电驱动的液膜萃取方法,可使带电目标物在直流电场作用下穿过支撑液膜进入接受溶液。因其快速高效,且具备一定的选择性,以该方法为原型的电膜萃取技术逐渐发展起来,并在生命[73,74]、环境[75]、医药[76,77]、食品[78]等复杂样品制备中得到有效应用。传统的液相分离系统以目标物的浓度梯度为驱动力,而电膜萃取技术将电场这一能量场引入液相分离系统,不仅向系统中输入能量、加速传质,还驱动带电目标物在电场中定向迁移,进一步加速萃取过程[79]。电膜萃取中的支持液膜则起到消除基质干扰的重要作用,选用适当或改良膜材料可提升该样品前处理技术的选择性[80]。通过样品溶液和接受溶液体积调控,电膜萃取也能应用于痕量目标物的有效富集[80,81]。除此之外,与其他加速样品制备策略联用还能进一步提升电膜萃取的性能。例如采用阵列装置可对多个样品进行同时电膜萃取[73];与液相微萃取联用可拓宽电膜萃取技术的适用样品范围[75,82];通过在线联用技术使电膜萃取与其他样品制备/分离分析步骤自动进行,减少人为操作,提升样品分析性能[83,84]。

常见的电膜萃取模式包括中空纤维、平面模式、芯片式和微电膜萃取[80]。其中芯片式和微电膜萃取正受到越来越多的关注。据文献报道,电膜萃取技术制备的样品可通过LC[85]、LC-MS[83,86,87]、HPLC[78,88]、GC-MS[89,90]、CE[73,91]、MS[77,92]、伏安法[93]等方法进行分析。而集成多种高效样品制备特性的电膜萃取在线分离富集技术在复杂样品分析中优势明显。

将电膜萃取与电喷雾电离-质谱(ESI-MS)直接在线联用,Rye等[77]报道了相似的EME-ESI-MS在线联用技术,实现了生理pH条件下两性离子代谢物的有效分离富集与实时监测,并成功应用于大鼠肝微粒体中羟嗪和伏替西汀的代谢研究。Dugstad等[84]研发的EME-ESI-MS方法成功地将待测目标物从缓冲液和蛋白质中分离富集出来,避免离子抑制和质谱仪的污染,实现了大鼠肝脏微粒体中碱性药物阿米替林的药物代谢反应的实施监测。Fuchs等[94]将EME-ESI-MS在线联用技术用于阿米替林、异丙嗪和美沙酮3种不同药物的代谢动力学研究。他们的研究结果显示,与LC-ESI-MS相比,EME-ESI-MS在线联用技术在快速分析上呈现出巨大优势,可在20 s内完成单个样品分析,在药物代谢的监控中极具应用潜力。与快速傅里叶变换方波伏安法(FFTSWV)在线联用,Norouzi等[93]报道的EME-FFTSWV在线分析技术可在低电压下完成血液中格列本脲的高灵敏度检测。

图 4 芯片式电膜萃取-高效液相色谱-质谱在线联用示意图[86]Fig. 4 Schematic diagram of online combination of on-chip EME-HPLC-ESI-MS[86]

利用微加工技术实现的电膜萃取装置微型化,电驱动芯片膜萃取(on-chip EME)不仅可减少样品和溶剂的消耗,还能通过微流控技术精确操控流体定向流动,易于与各种样品制备/分析技术在线联用。Petersen等[92]将on-chip EME与ESI-MS直接在线联用,应用于阿米替林药物代谢研究,单个分析过程仅需9 s。On-chip EME将待测目标物从富含蛋白质和电解质的少量样品溶液中快速、高效地分离富集出来,再将目标物进行ESI-MS在线分析,该方法的重现性良好,在线on-chip EME-ESI-MS技术在少量样品的实时监控研究中展现出超强潜力。在on-chip EME与ESI-MS之间增加在线色谱分离步骤进一步提升样品制备效果,拓宽电膜萃取在线分离富集技术的应用。See等[86]介绍了一种在线on-chip EME-HPLC-ESI-MS分析系统,用于河水中氯化苯氧乙酸除草剂的测定。该在线分析系统通过注射泵(syringe pump)和阀(selection valve)控制流体在系统中的定向流动,在萃取芯片(extraction cell)上施加电压进行连续电膜萃取,萃取芯片末端的接收溶液出口与HPLC-MS仪器连接完成萃取物的在线分析(见图4)。Hansen等[87]也报道了类似的在线on-chip EME-HPLC-ESI-MS分析系统,并通过萃取芯片设计将电膜萃取的富集倍数提高到400,使得纳升级样品中痕量目标物的分析成为可能。在不断提升样品制备效果的同时,该在线分析技术的应用也从液体样品拓展到固体样品。例如,Kamankesh等[78]将on-chip EME-HPLC方法用于烤肉中多环芳香烃的检测。除了与分析仪器在线联用,on-chip EME还能与其他样品前处理技术在线联用,以取得更好的样品制备效果。Karami等[90]在芯片上加工EME单元和分散液液微萃取(DLLME)单元,利用离心力控制微通道中的流体流动方向,完成在线on-chip EME-DLLME,制备好的样品通过GC-MS进行分析。

电驱动微型膜萃取(μ-EME)是EME的微型化模式,且样品与接受溶液之间换用自由液膜,不再需要膜体支撑。μ-EME中可精确控制溶液体积,而透明装置则利于实时观察萃取过程,是电膜萃取理论研究的利器。Kubáň课题组在μ-EME理论[91,95,96]与应用[85,97]研究上做出了众多贡献。该课题组的最新研究进展之一是将μ-EME与HPLC在线联用[85],不仅保留了萃取速度快的优势,还实现了自由液膜的自动更换,有效避免了μ-EME样品残留和膜容量损失的问题。

电膜萃取在线分离富集技术在几秒钟的时间能完成样品分离富集,且富集效果超过两个数量级,已在药物代谢研究中展现出应用潜力。通过装置微型化,on-chip EME和μ-EME可用于小体积样品的超快速分离分析,而与其他样品前处理技术的在线联用以及先进膜材料的研究也将拓宽该技术的应用范围。

4 结论与展望

在复杂样品分析中,如何快速、高效地从复杂成分的实际样品中将痕量的目标化合物进行分离富集,是提高分析灵敏度、选择性和准确性的关键。以电场为驱动力的在线分离富集技术,既能向体系做功,又能驱动样品在分离、富集、检测各步骤之间定向迁移,保证熵减过程顺利进行,是快速样品制备的有效途径。本文综述了电驱动毛细管分离富集、电驱动芯片分离富集和电驱动膜萃取3种模式电驱动的在线快速分离富集技术研究进展。讨论了该技术中基于电场的能量输入、电驱动定向流加速传质、在线集成策略和装置微型化等加速样品分离富集的方法与原理。基于电驱动的在线分离富集技术具有速度快、分离富集效果好、自动化程度高的优势。但是该技术多与电泳、质谱分析技术联用,在复杂样品中的应用较少。分析化学所面对的样品复杂程度越来越高,发展快速分离富集技术对复杂样品分析意义重大,未来基于电驱动在线快速分离富集技术研究将集中在以下几个方面:(1)集成先进的样品前处理材料与技术,进一步提高分析方法的选择性和灵敏度,加快分析速度。(2)与色谱、拉曼光谱等高性能检测器在线联用,拓宽基于电驱动在线快速分离富集技术的应用领域,并为相关色谱、光谱检测提供快速有效的前处理技术。(3)针对食品、环境、医药等领域快速检测需求,发展可用于复杂样品分析的基于电驱动在线快速分离富集的快速检测技术。