超高效液相色谱—四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速测定草鱼中7种激素

周艳华 - 李 涛 张鹏飞 -

(1. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004；2. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111；3. 湖南湘典食品有限公司，湖南 长沙 410031)

草鱼为中国重要淡水经济养殖鱼类，年产量连续多年位居首位，水产品中药物残留一直是社会关注的热点。雄激素和孕激素是类固醇激素，能影响动物性别分化，具有强而持久的蛋白同化作用，可促进动物超常态生长，大幅提高养殖经济效益[1-2]，被广泛应用于养殖业[3]。食用含有激素残留的水产品会干扰人体正常激素平衡，影响人体正常代谢功能，导致发育异常，具有潜在的致癌风险以及较大的危害性[4-5]。为保障食品安全，农业部第235号公告和GB 31650—2019规定了水产品中不得检出雄激素、孕激素类药物残留。

目前，雄激素、孕激素检测主要有液相色谱法[6-7]、气质联用法[8-10]、液质联用法[11-12]等。高效液相色谱法灵敏度低，检测项目单一，定性分析易受干扰；气质联用法需进行衍生化反应，操作繁杂；液质联用法具有灵敏度高、选择好、抗干扰能力强等优点，但前处理方法繁杂，耗时较长，回收率低，而采用QuEChERS净化工艺，可大大缩短检测时间，提高检验效率。近年来，以四级杆/飞行时间质谱和四级杆/轨道阱质谱为代表的高分辨质谱技术具有高特异性、高准确度和高分辨率等优点[13]，已应用于农药残留[14]、兽药残留[15-16]及保健食品非法添加[17]等领域，但未见应用于草鱼中雄激素、孕激素的检测。

试验拟对草鱼基质中7种雄激素和孕激素类药物残留进行检验研究，优化其提取试剂与提取方法，采用QuEChERS净化工艺替代传统固相萃取净化法，并应用空白基质匹配法替代内标法，采用四级杆/轨道阱高分辨质谱替代传统液相质谱检测7种激素，建立一种草鱼中7种激素药物残留的快速检测方法，并进行方法有效性研究，评价其7种激素的基质效应，旨在为利用高分辨质谱测定雄激素、孕激素的方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜草鱼：市售；

Hypersil Gold C18色谱柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国 CNW公司；

甲酸：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；

NH2萃取剂、C18萃取剂、HLB萃取剂：40～63 μm，60 A，德国CNW公司；

丙酸睾酮(CAS 57-85-2，纯度99.7%)、甲睾酮(CAS 58-18-4，纯度98.0%)、睾酮(CAS 58-22-0，纯度98.5%)、勃地酮(CAS 846-48-0，纯度98.5%)、诺龙(CAS 434-22-0，纯度99.0%)、群勃龙(CAS 10161-33-8，纯度96.3%)、孕酮(CAS 57-83-0，纯度99.3%)标准品：德国Dr公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱串联四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱：Q Exactive Focus型，美国Thermo Fisher Scientific公司；

电子分析天平：ME204E型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

高速冷冻离心机：JXN-26型，贝克曼库尔德(美国)股份有限公司；

高速振荡器：CM-1000型，东京理化器械株式会社。

1.3 质谱条件优化

HESI离子源下，采用PRM/Targeted-MS2扫描， 扫描范围m/z50～400，分辨率35 000，毛细管电压3 000 V；电喷雾离子源温度325 ℃，汽化温度360 ℃；鞘气压0.24 kPa；辅助气压0.091 kPa；离子传输管温度325 ℃；喷雾电压4.0 kV。取标准溶液直接质谱，通过Full MS扫描确定电离模式和母离子m/z，通过SIM扫描确定定量离子和定性离子。

1.4 液相色谱条件优化

相同洗脱程序和色谱柱条件下，选择0.1%甲酸溶液为无机流动相，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈为有机流动相，考察分离效果。色谱柱Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流动相A为无机流动相，流动相B为有机流动相；采用梯度洗脱模式(见表1)进样；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样体积5 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.5 样品前处理工艺优化

1.5.1 提取剂 取草鱼可食用部分充分匀浆，精密称取2.0 g于50 mL离心管中，平行样6份，加入提取剂10 mL，振摇1 min，超声15 min，离心，取上清液，残渣加入10 mL提取剂，振荡摇匀15 min，离心，合并上清液，混匀，冷冻2 h，高速冷冻离心，上清液过0.22 μm滤膜，上机测定，计算平均回收率。分别选择甲醇、乙腈、1%甲酸—乙腈进行优化，选择最佳提取剂。

1.5.2 净化剂 最优提取条件下获取样品提取液4.0 mL，萃取剂种类选择分别加入200 mg C18、HLB、NH2萃取剂，平行样6份，萃取剂用量组分别加入100，200，300 mg C18萃取剂，平行样6份，振荡混匀，高速离心，上清液过0.22 μm滤膜，上机测定，计算平均回收率。

1.6 线性范围、检出限和定量限测定

取空白样品按最优前处理工艺制备空白基质溶液，配制1.0～100.0 ng/mL基质标准溶液，以峰面积响应值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。在空白草鱼样品中添加低浓度混合标准溶液，按样品制备方式处理，进液质联用仪检测，化合物测定S/N≥3的浓度为检出限，S/N≥10的浓度为定量限。

1.7 准确度和精密度测定

空白草鱼样品中加入7种激素混合标准溶液，加标后样品浓度分别为2.0，4.0，20.0 μg/kg，每个浓度样品制备6份，测定7种激素含量，计算回收率和RSD值。

1.8 基质效应评价

取空白草鱼基质样品，按最优前处理工艺处理样品后，配制空白基质混合标准系列溶液，经液质联用仪测定后得空白基质标准曲线，同时取溶剂配制与基质标准曲线浓度一致的溶剂标准系列溶液，经液质联用仪测定得溶剂标准曲线[18]。根据基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值来评价基质效应。

1.9 草鱼样品检测

依据上述最优样品前处理工艺进行处理，最优仪器条件下检测样品中7种激素，质谱采集数据采用保留时间进行定性，结合离子丰度比和二级特征离子进行确证。

1.10 数据处理

采用Excel软件对试验数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

由表2可知，7种激素在正离子模式下响应值最高，得到的化合物母离子质荷比均为[M+H]+。其中丙酸睾酮、甲睾酮、睾酮和孕酮具有相同的碎片离子，且定量与定性离子相同。

表2 7种激素的质谱参数表†

2.2 液相色谱条件优化

由图1知，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈均能分离7种激素，且目标物在10 min内得到了有效分离，其中0.1%甲酸—乙腈的分离效果及响应值最高。目标化合物极性小，易与C18色谱柱结合，乙腈洗脱能力强于甲醇，出峰时间更快，乙腈分离效果优于甲醇。目标化合物采用正离子模式分析，加入低浓度甲酸有利于提供正电荷，离子化效率大大提高，因此，0.1%甲酸—乙腈响应度高于乙腈。

图1 7种激素混合标准溶液定量离子色谱图

2.3 提取剂优化

由图2可知，3种提取剂中，1%甲酸—乙腈提取的目标化合物回收率最高，甲醇提取的回收率最低。甲醇提取时，水溶性蛋白进入提取液影响了目标化合物的电离，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，降低了提取液中基质的干扰，在酸性环境下更有利于雄激素和孕酮的提取。试验采用二次提取法，充分提取了样品中目标化合物，保证了最佳提取效果。样品提取液冷冻后，脂肪转换为固态，通过离心去除后可有效降低提取液中基质干扰，提高目标物回收率。

图2 提取剂对目标物回收率的影响

2.4 净化条件的优化

由图3可知，3种净化剂中，使用NH2和C18净化后，目标化合物回收率为75%～110%，C18净化剂净化后回收率高于NH2；而使用HLB净化剂后，仅丙酸睾酮回收率>60%，其他化合物回收率均<60%，表明HLB净化剂对目标化合物有吸附作用。C18吸附剂能去除脂肪和酯类等非极性干扰物，故选择C18净化剂作为净化工艺净化剂。

图3 吸附剂对目标物回收率的影响

由图4可知，相同体积提取液中，当C18净化剂用量为200 mg时，目标化合物回收率最高；当C18净化剂用量为100 mg时，净化剂量少而净化效果差，目标化合物回收率最低；当C18净化剂用量为300 mg时，目标化合物回收率低于净化剂用量为200 mg的，表明过多的净化剂会吸附部分目标化合物，且增加检测成本。故C18净化剂的最适用量为200 mg。

图4 C18吸附剂用量对目标物回收率的影响

2.5 线性范围、检出限和定量限分析

由表3可知，当激素浓度为1.0～100.0 ng/mL时，7种激素线性关系良好(R2≥0.998)，检出限为0.04～0.60 μg/kg，定量限为0.2～1.8 μg/kg，表明利用基质溶液配制标准溶液能有效降低基质增强与抑制效应，可准确检测目标化合物含量。

表3 7种激素的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 准确度和精密度分析

由表4可知，当加标浓度为2.0 μg/kg时，回收率为71.4%～103.5%，RSD为4.8%～7.8%；当加标浓度为4.0 μg/kg时，回收率为79.4%～106.9%，RSD为2.4%～7.6%；当加标浓度为20.0 μg/kg时，回收率为81.0%～106.5%，RSD为4.1%～6.2%。3个梯度加标回收率和精密度良好，表明该方法具有较好的准确度和精密度，能满足草鱼实际样品中雄激素和孕激素的检测要求。

表4 7种激素的回收率和精密度

2.7 基质效应评价

由图5可知，7种激素均表现为基质抑制效应，且比值均<80%，表明此方法检测草鱼中7种雄激素和孕激素呈强抑制效应。基质效应与液相串联质谱特性相关，不能完全消除基质效应，在评估基质效应的基础上，可通过优化样品前处理方法、使用合适的内标、采用基质标准溶液校正等方式降低和补偿基质效应，从而获得准确的定量结果。内标法成本昂贵，试验采用空白基质匹配标准曲线以补偿基质效应。

图5 7种激素的基质效应

2.8 实际样品检测

采用试验建立的检验方法对市场采购的20批次鲜活草鱼进行检测，均未检出上述7种雄激素、孕激素。

3 结论

建立了一种超高效液相色谱串联阱高分辨质谱检测草鱼中7种雄激素、孕激素的方法，优化了前处理方法中的提取工艺与净化工艺，建立了QuEChERS样品处理方法，并对线性方程、检出限、定量限、回收率等方法学指标进行了验证。结果表明，试验方法相较于SN/T 4744—2017和农业部1031号公告-1-2008 SPE净化法，大大缩短了检验时间，降低了检验成本，且回收率更高，能满足草鱼实际样品中雄激素和孕激素的检测要求。试验在QuEChERS样品前处理工艺中缺少复配净化剂研究，检验方法的多基质样品适用性研究不够。