山西老陈醋发酵和熏醅过程中有机酸的变化分析
2020-09-17杨宇霞李慧王争争赵欣杨林娥李婷
杨宇霞，李慧，王争争，赵欣，杨林娥，李婷
(山西省生物研究院有限公司，太原 030006)
山西老陈醋是我国传统四大名醋之一[1-3]，其传统酿造工艺以高粱、麸皮、谷糠、大麦、豌豆等五谷为原料[4,5]，运用低温酒醪液体发酵、高温接种引火、熏淋醋醅结合制醋、夏伏晒冬捞冰的贮陈老熟等多种方法，经“蒸、酵、熏、淋、陈”五个步骤酿制而成[6]。由于其选料上乘、工艺独特[7]，形成了山西老陈醋绵、酸、香、甜、鲜的风味特点[8]。有机酸是山西老陈醋酸味的主要来源[9]，其种类和含量与山西老陈醋的品质、风味有着密切的关系[10-12]。
酒精发酵、醋酸发酵和熏蒸是山西老陈醋生产的主要工艺过程[13]。酒精发酵和醋酸发酵过程是在醋酸菌、酵母菌、霉菌等多种微生物及其所产生的酶类共同作用下进行的生物化学反应。酒精发酵阶段伴随着酒精和二氧化碳大量生成，还有酯类、酸类、醇类等香味物质及其前体物质的生成[14]；醋酸发酵过程中，在醋酸菌氧化酒精生成醋酸的同时，许多其他菌种也共同参与发酵而生成了多种有机酸[15]；熏醅阶段，醋醅在高温环境条件下发生了水解、美拉德、焦糖化等一系列复杂的化学反应，在此过程中有机酸与醇类化合物反应生成了酯类物质。可见，有机酸的生成及变化贯穿于山西老陈醋发酵和熏蒸的整个过程，有机酸可作为评价发酵及熏醅过程的重要指标[16，17]，研究有机酸的变化对优化山西老陈醋发酵及熏醅过程工艺参数、提高山西老陈醋品质具有非常重要的意义。
本研究采用高效液相色谱法对山西老陈醋酒精发酵、醋酸发酵和熏醅过程中的有机酸进行了测定，分析此过程中有机酸含量的变化趋势，为酿造风味独特的山西老陈醋提供优化工艺的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品来源
取山西老陈醋传统生产工艺3条生产线酒精发酵、醋酸发酵和熏醅阶段的样品，共计19个。分别为酒精发酵第1天(J1)、第2天(J2)、第3天(J3)、第18天(J18)，醋酸发酵第1～9天(C1～C9)，熏醅阶段第1～6天(X1～X6)。
1.1.2 主要试剂
甲酸(分析纯)、乳酸(分析纯)、磷酸(优级纯)：北京化工厂；苹果酸(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；冰乙酸(分析纯)：天津市光复科技发展有限公司；柠檬酸(分析纯)：天津市天力化学试剂有限公司；琥珀酸(色谱纯)、α-酮戊二酸(色谱纯)：Sigma-Aldrich公司；甲醇(色谱纯)：赛默飞世尔科技(中国)有限公司；亚铁氰化钾(分析纯)：天津市光复精细化工研究所；硫酸锌(分析纯)：天津欧博凯化工有限公司；磷酸二氢钾(优级纯)：北京精求化工有限责任公司；实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
1100型高效液相色谱仪(配有四元泵、真空脱气机、自动进样器、可变波长紫外检测器和化学工作站) 美国安捷伦公司；KQ-500D型超声波清洗仪 东莞市科桥超声波仪器有限公司；TG16-WS型高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；BSA224S型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；NW150V型超纯水系统 上海康雷分析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品预处理
酒精发酵阶段：取当日酒醅样品，用滤纸过滤，滤液备用为试验样品。
醋酸发酵阶段：取当日醋醅样品，称取10.00 g样品，加入90 mL新煮沸冷却的蒸馏水浸泡1 h，然后用滤纸过滤，滤液备用为试验样品。
熏醅阶段：取当日熏醅样品，之后的操作同醋醅样品。
1.3.2 提取
取2 mL试验样品，加入2 mL 10.6%亚铁氰化钾溶液和2 mL 30%硫酸锌溶液，用超纯水稀释定容至25 mL，摇匀，10000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，为待测样品，上机测定。
1.3.3 色谱分析条件
色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值为2.7)∶甲醇为97∶3；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；检测器：可变波长紫外检测器；检测波长：210 nm。
1.3.4 标准溶液的配制
分别准确称取甲酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸0.1000 g，用超纯水溶解并定容至10 mL，充分摇匀，保存于4 ℃冰箱备用。使用时用流动相分别稀释成不同质量浓度的混合标准系列工作溶液，见表1。
表1 有机酸混合标准溶液浓度系列Table 1 Organic acid mixture standard solution concentration series μg/mL
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
将混合标准系列工作溶液按质量浓度由低到高的顺序进样分析，以色谱图中各有机酸的峰面积对其相应的质量浓度进行线性回归，绘制各有机酸峰面积与质量浓度工作曲线，结果见表2，标准溶液色谱图见图1。
表2 不同有机酸的线性方程及相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients of organic acids
图1 有机酸标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of organic acid standard solution
结果表明，采用高效液相色谱法测定各种有机酸的含量，甲酸质量浓度在10～1000 μg/mL、苹果酸质量浓度在5～500 μg/mL、α-酮戊二酸质量浓度在1～100 μg/mL、乳酸质量浓度在10～1000 μg/mL、乙酸质量浓度在10～1000 μg/mL、柠檬酸质量浓度在10～1000 μg/mL、琥珀酸质量浓度在15～1500 μg/mL时，各有机酸质量浓度与色谱峰响应面积呈现良好的线性关系，可用于山西老陈醋发酵及熏醅过程中有机酸的定量分析。
2.2 山西老陈醋发酵及熏蒸过程中各有机酸含量分析
采用高效液相色谱法测定山西老陈醋3条生产线酒精发酵、醋酸发酵和熏醅阶段的样品中甲酸、苹果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸7种有机酸的含量，结果见表3～表5。
表3 A生产线各有机酸含量Table 3 Organic acids’ content of production line A
续 表
表4 B生产线各有机酸含量Table 4 Organic acids’ content of production line B
表5 C生产线各有机酸含量Table 5 Organic acids’ content of production line C
由表3～表5结果可知，山西老陈醋酒精发酵、醋酸发酵和熏醅过程中总有机酸含量整体呈上升趋势，有机酸总量随着时间的延长而逐渐增加，其中醋酸发酵阶段总有机酸含量增速最快，由醋酸发酵开始的2000 mg/100 g醋醅上升至醋酸发酵结束时的6000 mg/100 g醋醅，提高了3倍多。说明醋酸发酵阶段是山西老陈醋生产过程中有机酸生成的主要阶段。此外，乳酸和乙酸含量占总有机酸含量的70%以上，是所有有机酸中最主要的组成部分，乳酸和乙酸含量的变化趋势与总有机酸的变化趋势相一致。乳酸是山西老陈醋有机酸中最主要的不挥发性有机酸，大量生成于酒精发酵后发酵阶段，醋酸发酵阶段前期小幅上升而后缓慢下降，到熏醅阶段乳酸含量又略有回升。乙酸是所有有机酸中含量最多的有机酸，在山西老陈醋酒精发酵、醋酸发酵和熏醅过程中整体呈上升趋势，其中醋酸发酵阶段是乙酸生成的主要阶段，尤其是醋酸发酵的2～4 d，乙酸含量大幅上升。苹果酸、柠檬酸和琥珀酸是山西老陈醋中含量较丰富的有机酸，甲酸次之，α-酮戊二酸含量最低。苹果酸在醋酸发酵阶段变化较小，熏醅阶段呈上升趋势。琥珀酸整体呈缓慢而平稳的上升趋势。甲酸在整个过程中呈较平缓的上升趋势，其中醋酸发酵阶段呈先上升后下降又上升的起伏变化现象，可能是由于甲酸属于含量较低的挥发性有机酸，不同生产线间甲酸含量差异较大。α-酮戊二酸是所有有机酸中含量最低的，酒精发酵阶段其含量较低，主要生成于醋酸发酵阶段，且在醋酸发酵阶段变化比较平稳，最后在熏醅阶段尤其是熏醅后期含量有较明显的上升。
3 结论与讨论
山西老陈醋传统固态发酵工艺以高粱、麸皮、谷糠等为原料，以大曲作为糖化剂发酵，霉菌、酵母菌、醋酸菌等多种微生物定向消长、顺序代谢，完成酿造过程，是一个复杂的生物化学反应过程。独特的原料、复杂的微生物、特殊的酿造工艺造就了山西老陈醋发酵和熏醅过程中有丰富的有机酸产生，多种有机酸共同作用形成了山西老陈醋酸味醇厚绵长、柔和可口的特点。
研究采用高效液相色谱法对山西老陈醋酒精发酵、醋酸发酵和熏醅过程中有机酸进行了测定。从高效液相色谱法测定结果来看，山西老陈醋发酵和熏醅过程中有机酸组成比较丰富，且随着生产过程的进行，总有机酸含量持续上升。同时，除乳酸外，酒精发酵阶段各种有机酸含量均比较低，而乳酸在酒精发酵后期含量迅速增加，可能是由于乳酸菌属于厌氧菌，酒精发酵后期封缸厌氧发酵状态适合于乳酸菌的大量繁殖，从而产生大量乳酸。醋酸发酵阶段是甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸等多种有机酸生成的主要阶段。尤其是乙酸含量由醋酸发酵开始的100 mg/100 g醋醅上升至醋酸发酵结束时的4000 mg/100 g醋醅，提高了40多倍。熏醅阶段各种有机酸含量均呈现上升的趋势，总有机酸含量也呈上升趋势，但是其中挥发性酸所占比例呈下降趋势，不挥发性酸所占比例呈上升趋势，这与熏醅过程中水分和挥发性酸的蒸发有关系。
在对山西老陈醋发酵和熏醅过程中有机酸研究的基础上，还需进一步对产生多种有机酸的相关微生物进行研究，找出其中的对应关系，以期深入了解山西老陈醋的发酵机理，为优化山西老陈醋传统生产工艺提供一定的理论依据。
