玉米胚芽脱脂粕水解物的分离及抗氧化性质研究

孙天颖，程红，张明站，任健*

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省玉米主食工业化工程技术研究中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

近年来，食品工业对蛋白水解物的关注日益增加，蛋白质被分解成小分子量的低聚肽，可被肠道黏膜直接吸收，并且其吸收速度略快于氨基酸[1]。蛋白水解物除具有营养作用外，还可发挥蛋白质整体结构所不具有或不明显的特殊功能，如抗氧化、免疫调节、美容护肤、血压和血脂调节、护肝等[2]。此外，蛋白水解还能够进一步改善蛋白的溶解性、起泡性等功能性质，功能蛋白水解物可作为食品添加剂、食品质地改良剂和药物添加剂，被广泛应用于食品或制药行业。

玉米蛋白主要存在于玉米淀粉湿法加工的副产物玉米蛋白粉、玉米胚芽和玉米浆中，每加工万吨的玉米就会产生300～350吨的玉米浆、350吨的胚芽饼以及600吨的玉米蛋白粉，蛋白资源丰富，并且开发利用前景广阔。因为玉米蛋白的水溶性较差，限制了其在食品工业中的应用。但与其他谷物蛋白相比，由于玉米蛋白特殊的氨基酸组成和序列，是研究开发生物活性肽的良好原料[3]。目前研究和报道的有玉米蛋白水解物的抗氧化、解酒护肝、降血压、增强免疫力等功能[4-8]，并有相关产品已实现产业化生产。本文主要采用超滤、凝胶层析对玉米胚芽脱脂粕水解物中具有抗氧化活性的肽进行初步分离，筛选抗氧化活性较强的组分，同时，检测玉米胚芽脱脂粕水解物的体外抗氧化活性作用，为玉米胚芽脱脂粕的研究前景以及相关功能性产品的开发提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

玉米胚芽脱脂粕：蛋白含量24.15%，自制；Alcalase碱性蛋白酶：无锡杰能生物工程公司；Flavourzyme风味蛋白酶：丹麦Novo Nordisk公司；牛血清白蛋白：GE公司；Sephadex G-15：Pharmacia公司；焦性没食子酸、邻二氮菲等其他试剂：均为分析纯。

1.2 主要设备仪器

DL-360E型智能超声波清洗器 上海之信仪器有限公司；HH.S21-1型电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器械有限公司；B324型凯氏定氮仪 日立公司；PB-10型pH计 上海精密科学仪器有限公司；DU800型紫外可见分光光度计 贝克曼公司。

1.3 实验方法

1.3.1 玉米胚芽脱脂粕水解物的制备

玉米胚芽脱脂粕→过筛(过100目筛)→超声波处理(超声功率214 W，超声时间30 min，超声温度55 ℃)→碱性蛋白酶水解(加酶量5%，W/W)，水解温度45 ℃，pH值10.5，时间180 min)→调pH值→风味蛋白酶水解(加酶量3%，W/W)，水解温度50 ℃，pH值6.2，时间240 min)→离心取上清液→浓缩冻干。

1.3.2 玉米胚芽脱脂粕水解液的分离及抗氧化性质研究

1.3.2.1 超滤

在10000 r/min条件下离心脱脂后的玉米胚芽酶解液20 min，采用10 kDa、6～10 kDa以及6 kDa截断分子量的超滤膜逐级超滤上清液，每超滤一级，检测其溶液抗氧化活性，直至检测至最后一次超滤后的上清液活性。

1.3.2.2 凝胶层析

采用Sephadex G-15凝胶层析对样品进行分子量分级，参考Amersham Pharmacia凝胶层析原理与手册的方法(2002年)。选取规格为2.6 cm×80 cm的双蒸水平衡柱作为层析柱，用双蒸水溶解已被超滤的样品，采取100000 r/min的条件离心上述溶液10 min，提取上清液。再将上述上清液加入凝胶柱中，用双蒸水以0.5 mL/min的流速进行洗脱，同时以4 mL/管的收集器自动收集，检测每管收集器里收集液的抗氧化活性(214 nm处测定吸光值)，选取活性最高的样品组分进行冻干。

1.3.2.3 清除超氧阴离子自由基活性的测定

测定采用改进的邻苯三酚自氧化法[9]。

1.3.2.4 清除羟自由基活性的测定

采用邻二氮菲-Fe2+氧化法。

1.3.2.5 玉米胚芽粕水解物清除DPPH自由基的测定

配制成不同浓度的水解液，分别取1 mL与3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液均匀混合，反应30 min后在517 nm处测定其吸光度Ai，同法测定3 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液与1 mL蒸馏水混合后的吸光度Ac以及供试液本身的吸光度Aj，按下式计算清除率Y。

清除率Y=1-(Ai-Aj)/Ac。

式中：Y为DPPH·自由基清除率；Ac为不加供试液的吸光度；Ai为加入供试液后的吸光度；Aj为供试液本身的吸光度。

1.3.2.6 玉米胚芽粕水解物对油脂氧化的抑制作用

取一定量的大豆色拉油(0.5%，W/W)置于烧杯中，加入玉米胚芽粕水解物(已被逐级超滤和凝胶层析作用过的样品)，每组做3次平行，然后放入(65±1)℃恒温培养箱中反应，每隔24 h搅拌一次样品并测量样品的过氧化值(POV值)。本实验按照GB/T 5009.37-2003标准操作，采用油脂的氧化速度(POV值)表示油脂抗氧化能力。

1.3.2.7 玉米胚芽粕水解物还原力的测定

在试管中依次加入pH值为6.6的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液、1%六氰合铁酸钾和各种不同浓度梯度的玉米胚芽粕水解液，每种试剂加入试管的体积均为0.75 mL。将混合溶液于50 ℃水浴20 min，然后加入0.75 mL的10%三氯乙酸，以4 ℃、3000 r/min的条件下离心上述溶液10 min，提取出1.5 mL上清液，再分别加入1.5 mL的蒸馏水和0.1%的FeC13，快速摇匀，室温静置反应10 min后，以蒸馏水调零，在吸光度为700 nm处测定上述样品的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 超滤分离结果分析

超滤是介于微滤和纳滤之间的一种膜过滤。为从玉米胚芽粕酶解液中得到不同分子量的多肽，本方法采用截断分子量为10 kDa、6～10 kDa和6 kDa的超滤膜按照顺序逐步分离玉米胚芽粕酶解液，结果见表1。

表1 样品超滤的结果分析Table 1 The analysis result of hydrolysates by ultrafiltration

由表1可知，超滤分级后分子量小于6 kDa的组分抗氧化活性最高。外液(<6000 Da)的抗氧化活性高达481.76 U/mL，是内液II(10000～6000 Da)的3倍以上，是内液I(>10000 Da)的8倍以上，证明抗氧化活性肽多聚集在<6 kDa区段，并且小分子量的玉米胚芽粕多肽更易被吸收利用。

2.2 Sephadex G-15凝胶层析分离

对经过超滤的抗氧化活性肽进一步进行凝胶层析分离，实验结果见图1。

图1 Sephadex G-15管数凝胶层析的洗脱曲线Fig.1 The elution curve of Sephadex G-15 gel chromatography

经Sephadex G-15凝胶层析后得到G1、G2、G3、G4 4个组分，测定其抗氧化活性依次为57.19，287.43，149.28，27.37 U/mL。由图1可知，G2组分的抗氧化活性最高。

2.3 玉米胚芽粕水解物对超氧阴离子自由基的清除作用

将原玉米胚芽粕水解物溶液配制成浓度梯度为0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的样品，各浓度梯度的样品对O2-·的清除效果见图2。

图2 玉米胚芽粕水解物对超氧阴离子自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysates on superoxide anion free radical

由图2可知，玉米胚芽粕水解物对O2-·的清除作用具有显著影响，且随样品浓度的增大而增强。浓度在0.5～4 mg/mL之间的样品的O2-·清除作用由181.80 U/mL大幅度增加到526.92 U/mL，但当样品浓度从4 mg/mL持续增大到5 mg/mL，样品的O2-·的清除作用基本不发生变化，由此可得浓度为4 mg/mL的玉米胚芽粕水解物对O2-·的清除作用最强。

2.4 玉米胚芽粕水解物对羟自由基的清除作用

将原玉米胚芽粕水解物溶液配制成浓度梯度为0.5，1，2，3，4，5，6 mg/mL的溶液，各浓度梯度的样品对·OH的清除作用见图3。

图3 玉米胚芽粕水解物对·OH的清除作用Fig.3 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on · OH

由图3可知，玉米胚芽粕水解物对·OH 的清除作用具有显著影响，并且随着水解物浓度的增大而增强。当浓度为0.5 mg/mL时，·OH的清除率仅为14.70%；当浓度为6 mg/mL时，·OH的清除率可达94.52%。玉米胚芽粕水解物和清除率之间的关系大致为：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905。

样品浓度从0.5 mg/mL持续增长到6 mg/mL时，样品对·OH的清除率从14.70%极速增长到94.52%，这期间的清除率均呈现逐渐上升的趋势。样品和清除率之间的关系大致为：y=0.8475x2+8.9518x+11.725，R2=0.9905，清除能力(EC50)为3.27 mg/mL。由此可得，浓度为6 mg/mL的玉米胚芽粕水解物对·OH的清除作用最强。

2.5 玉米胚芽粕水解物对DPPH·的清除作用

将原玉米胚芽粕水解物溶液配制成浓度梯度为0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的样品，各浓度梯度的样品对DPPH·的抑制作用见图4。

图4 玉米胚芽粕水解物对DPPH·的清除作用Fig.4 The scavenging effect of corn germ meal hydrolysate on DPPH·

由图4可知，玉米胚芽粕水解物对DPPH·具有抑制作用，浓度越大抑制作用越强。当样品浓度从0.5 mg/mL升至5 mg/mL时，玉米胚芽粕水解物对DPPH·的抑制率呈现正比上升关系，从只有5.84%高速增长至近90%，尤其浓度大于2 mg/mL后，上升趋势更加明显。样品与DPPH·抑制率的关系大致为：y=-1.6094x2+29.048x-9.7791，R2=0.9913，50%清除能力(EC50)为 2.37 mg/mL。

2.6 玉米胚芽粕水解物对油脂氧化的抑制作用

本实验以加入的玉米胚芽粕水解物作为样品对照组，以不加水解物做空白对照组，检测样品对油脂氧化的作用，结果见图5。

图5 玉米胚芽粕水解物对油脂氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition of corn germ meal hydrolysates on oil oxidation

由图5可知，随着时间的增加，油脂的POV值均呈现上升的趋势，而POV值越高，表明油脂被氧化的作用越强。虽然添加了玉米胚芽粕水解物的样品组随时间增加，POV值也不断增加，但是与空白对照组的上升趋势相比相对平缓一些。综上所述，玉米胚芽粕水解物具有抗油脂氧化作用。

2.7 玉米胚芽粕水解物还原力大小

将原玉米胚芽粕水解物溶液配制成浓度梯度为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mg/mL的样品，并检测不同浓度下的还原力大小，结果见图6。

图6 玉米胚芽粕水解物的还原作用 Fig.6 The reduction activity of corn germ meal hydrolysates

由图6可知，当样品浓度从0.1 mg/mL增长至0.6 mg/mL时，样品的吸光度呈上升趋势，表明浓度越大，玉米胚芽粕水解物的还原力越强；当浓度从0.6 mg/mL提高到1 mg/mL时，样品吸光度逐渐趋于平缓，但并没有下降的趋势，表明玉米胚芽粕水解物具有很强的Fe3+还原力。

3 结论

本文旨在以脱脂玉米胚芽粕水解物为主要研究对象，经超滤膜分级，分别筛选出分子量>10 kDa、10～6 kDa及<6 kDa的组分，并探讨其抗氧化能力。结果表明，分子量<6 kDa的脱脂玉米胚芽粕水解物的抗氧能力最强。并且该组分经凝胶层析分离进一步制备抗氧化活性肽，筛选得到4个活性组分G1、G2、G3、G4，其中G2组分的抗氧化活性最高。研究表明：玉米胚芽脱脂粕水解物具有较强的O2-·、·OH和DPPH·的清除能力以及抗油脂氧化能力和还原力。