牛至精油成分分析及其抗氧化性和抑菌活性研究

李娜，武晓英*，赵文婧，翟飞红，李晓君

(1.太原师范学院 生物系，山西 晋中 030619；2.中北大学 化学工程与技术学院，太原 030051)

牛至(OriganumvulgareL.)，又名满坡香、蘑菇草、披萨草、五香草、小叶薄荷、花八角、野荆芥、止痢草、马郁兰、土香薷等，为唇形科牛至属多年生草本或半灌木植物，在我国主要分布于河南、江苏、浙江、安徽、江西、福建、湖北、湖南、陕西、甘肃、新疆等地区[1]。牛至是一种药食同源植物，具有较高的药用和食用价值。牛至全草都可入药，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等作用，在生物农药、杀虫剂、抗氧化剂等天然产物[2,3]中的应用前景广阔，同时，牛至常作为一种烹饪调味料使用，用于烘烤类的烹饪以及肉类的除腥提鲜等，是一种天然的调味品及香料。

牛至精油是从牛至茎叶中提取得到的淡黄色澄清油状液体，挥发性很强，不易保存[4]，组成牛至精油的酚类化合物和萜烯类物质具有较强的抗菌和抗氧化活性[5]，评价牛至精油抗菌活性及杀菌效果的关键指标是香芹酚和百里香酚的含量和比例[6,7]。牛至精油中的主要抗氧化活性成分是酚酸类和萜类化合物[8,9]。酚酸类化合物苯环上的酚羟基是一种抗氧化活性基团，脱氢产生的苯氧自由基的稳定性与其清除自由基活性密切相关[10]。萜类化合物具有异戊二烯骨架并含有多个烯键，其化学性质活泼，并具有较强的还原性，可保护细胞膜和线粒体中的不饱和脂肪酸免受氧化，并保持膜的功能和完整性[11]。此外，牛至精油还具有毒性低、使用安全、成本低和经济效益高的优点[12]，因此，牛至精油已广泛应用于水果和蔬菜等食品的保鲜防腐领域。

目前关于香辛料的研究报道较多，尤其是对香辛料精油的研究更为广泛，如八角茴香精油、花椒精油、肉桂精油等[13-16]。而对牛至这种调味品的研究相对较少，尤其对牛至精油成分的分析缺乏系统的总结和探讨。因此，本文采用水蒸气蒸馏法提取牛至精油，并利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析牛至精油的组成成分。以BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)作为对照，对牛至精油清除DPPH和ABTS自由基能力进行测定，初步探究牛至精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力，为牛至精油的综合开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛至：购自亳州仙养御膳药业有限公司；正己烷(色谱纯)：Aladdin试剂公司；DPPH(分析纯)、ABTS(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；所有其他有机溶剂均为国产分析纯。

供试菌株：大肠杆菌(EscherichiacoilCGMCC 44568)、金黄色葡萄球菌(StaphylococusaureusCGMCC 26085)均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛至精油提取

采用水蒸气蒸馏法提取牛至精油：将干燥牛至粉碎，过80目筛，置于圆底烧瓶中，以料液比1∶10加入蒸馏水，100 ℃进行提取，至无油状物馏出为止。

1.2.2 精油提取率测定

采用—定质量的牛至粉碎物提取所得精油的质量来计算精油提取率；按公式(1)计算：

(1)

1.2.3 牛至精油组成成分GC-MS检测

采用Trace 1300系列气相色谱与ISQ单四极杆质谱检测器(Thermo Fisher Scientific，USA)相连，与气相色谱连接的柱子为TR-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。检测升温程序：55 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到250 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；检测器温度280 ℃；载气为氦气，流速1 mL/min。精油处理后以色谱纯正己烷稀释，进样量1 μL，分流比5∶1。质谱条件：电离能量为70 eV的电子轰击源，电子电离质谱范围在33～550 m/z。

1.2.4 牛至精油抗氧化性测定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除能力测定

取0.3 mL不同浓度的牛至精油样品于试管中，分别加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室温下在黑暗中反应30 min，在518 nm处测量吸光度值。以无水甲醇为空白参照，以BHT作为阳性对照。根据公式(2)计算DPPH自由基清除率，并计算半数抑制率IC50值。

(2)

式中：I为牛至精油对DPPH·的清除率；A0为DPPH·空白对照的吸光度值；As为样品与DPPH·反应后的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力测定

将7 mol/mL的ABTS和2.5 mol/mL的过硫酸钾溶液在室温下以等体积混合，并在黑暗中反应12～16 h以获得ABTS+·工作液。然后将获得的ABTS+·工作液用80%乙醇稀释，使其OD值在734 nm的条件下测得为0.7，备用。取0.3 mL不同浓度的牛至精油样品于试管中，加入2.7 mL ABTS+·工作液，混匀，暗反应30 min，以无水乙醇为空白参照，以BHT为阳性对照，在734 nm处依次测量吸光度值，根据公式(3)计算ABTS自由基清除率，并计算出半数抑制率IC50值。

(3)

式中：I为牛至精油对ABTS+·的清除率；A0为ABTS+·空白对照的吸光度值；As为样品与ABTS+·反应后的吸光度值。

1.2.5 牛至精油抗菌活性研究

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于37 ℃恒温振荡培养箱中培养至对数生长期，然后用无菌水将活化的菌种稀释，配制细菌悬浮液，使细菌悬浮液中含有约106CFU/mL的细菌数量。移取100 μL不同供试菌种的细菌悬浮液均匀涂布在LB固体培养基上制成含菌平板。将3个已灭菌的圆形滤纸片(6 mm) 等距放置在每个含菌平板上，其中一个滴加5 μL蒸馏水作为空白对照，向另外两个中滴加5 μL牛至精油，把含菌平板置于37 ℃的恒温箱中培养24 h。测定抑菌圈直径，每个菌种重复3次。

2 结果与分析

2.1 牛至精油的提取率

采用水蒸气蒸馏法提取牛至精油，约需4 h，不再有精油馏出，即完成提取。平均提取率为0.15%，通过水蒸气蒸馏法获得的精油是淡黄色透明油状液体，具有浓烈的香气。

2.2 牛至精油气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析

牛至精油挥发性成分总离子流图见图1。

图1 牛至精油挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of essential oils from oregano

实验共检测出54种精油组成成分。利用峰面积归一化法并与NIST数据库对比及查阅相关文献资料，列出各组分及其相对含量，结果见表1。

表1 牛至精油化学成分Table 1 Chemical constituents of essential oils from oregano

续 表

由表1可知，分析出54种相对含量为0.1%以上的化合物，占精油总含量的91.04%，其中，牛至精油的主要成分是酚类和萜烯类化合物。有4种相对百分含量较高的化合物成分，分别是百里香酚(26.63%)、香芹酚(14.44%)、2-异丙基-1-甲氧基-4-甲基苯(11.75%)和松油烯(9.23%)。牛至精油的组成成分受客观因素的影响较大，如气候、土壤以及收获时间等，因此，本研究结果与文献[17-20]报道的有所不同，但也有多种共有成分，如α-蒎烯、柠檬烯、百里香酚、香芹酚、松油烯、石竹烯、法尼烯等。

图2 化合物质谱对比图及其结构式Fig.2 Comparison of mass spectra of compounds and their chemical structures

2.3 牛至精油的抗氧化性

2.3.1 牛至精油清除DPPH自由基能力

DPPH·是一种稳定的有机基团，DPPH 溶液在518 nm波长处有很强的吸收峰，具有特征性颜色紫色。当加入抗氧化物质时，来自抗氧化剂的1个电子与稳定的DPPH·电子配对，因此，DPPH的特征紫色变淡，抗氧化剂的浓度越高，DPPH溶液的颜色越浅，因此可根据加入抗氧化剂前后DPPH溶液吸光度值的变化来确定物质的抗氧化能力。牛至精油和BHT对DPPH自由基的清除能力结果见图3。

由图3可知，在实验浓度范围内，随着牛至精油和BHT浓度的增加，二者对DPPH自由基的清除能力都呈现对数增长趋势，其半数抑制率IC50值分别为1.41 μg/mL和4.10 μg/mL。可见，牛至精油清除DPPH 自由基的能力优于化学合成的抗氧化剂BHT，即牛至精油具有更强的抗氧化性。

图3 牛至精油(A)和BHT (B)对DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to DPPH·

2.3.2 牛至精油清除ABTS自由基的能力测定

ABTS在合适的氧化剂作用下被氧化成绿色的ABTS+·，并在抗氧化物存在时抑制ABTS+·的产生，使得绿色变淡，因此在734 nm处测量加入抗氧化物质前后ABTS+·的吸光度值变化，可以计算出样品的总抗氧化能力。牛至精油和BHT对ABTS自由基的清除能力结果见图4。

图4 牛至精油(A)和BHT(B)对ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to ABTS+·

由图4可知，在测量范围内，随着牛至精油和BHT浓度的增加，二者对ABTS+·的清除能力都呈现出对数增加，半数抑制率IC50分别为0.0103 μg/mL和1.3596 μg/mL。因此，牛至精油清除ABTS+·的能力显著优于BHT，即牛至精油具有比化学合成的抗氧化剂BHT更强的抗氧化活性。

2.4 牛至精油的抑菌性

牛至精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑菌效果见图5。

图5 牛至精油对大肠杆菌(A)和金黄色葡萄球菌(B)的抑菌圈Fig.5 The inhibition zone of oregano essential oils against Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

牛至精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为9.5 mm和6.5 mm，由此可以看出，同种精油对不同菌种具有不同的抑菌活性，在同等条件下，牛至精油对大肠杆菌的抑菌活性比对金黄色葡萄球菌的抑菌活性更强，牛至精油对大肠杆菌属中敏感度，对金黄色葡萄球菌属低敏感度，本结果与钱骅等[21]的研究结果一致，表明牛至精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用。

3 结论

本研究以天然植物牛至的次级代谢产物——牛至精油为研究对象，运用GC-MS技术分析了牛至精油的化学成分，并对其抗氧化性和抑菌性进行了初探。牛至精油主要含有酚类物质(如百里香酚、香芹酚等)及烯类物质(如松油烯、石竹烯、柠檬烯等)等，具有良好的抗氧化性和抗菌活性。牛至精油对DPPH自由基和ABTS自由基均有较强的清除能力，且清除能力都优于化学合成的抗氧化剂BHT。牛至精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有显著的抑菌性，而且在同等条件下，牛至精油对大肠杆菌的抑菌活性比对金黄色葡萄球菌的抑菌活性更强。因此，牛至精油具有来源安全、效果好等优点。本研究为牛至精油在食品保鲜、农药开发、动物免疫等方面的开发应用提供了一定的科学依据。