嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌单独发酵对菊芋泡菜的影响

2020-09-17徐清萍郭苗苗唐百芬唐培鑫胡丽亚孟君

中国调味品 2020年9期

徐清萍，郭苗苗，唐百芬，唐培鑫，胡丽亚，孟君

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州 450001；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450001)

泡菜应用历史悠久，主要是对蔬菜进行发酵而制作，能够较好地保留蔬菜中的营养成分，且微生物发酵过程中会产生一些对人体有益的代谢产物[1]。发酵分为人工发酵与自然发酵[2]，其中自然发酵主要是利用蔬菜自身微生物菌体来进行发酵，发酵周期较长，发酵结果不能人为控制，容易产生大量亚硝酸盐等有害物质，且是利用不明菌体发酵，自身存在着一定的风险；人工发酵是利用微生物接种来进行的，主要是采用乳酸菌发酵乳酸来制作，可以快速制成含酸较高、亚硝酸盐含量低的产品。

菊芋，又名洋姜、鬼子姜，为菊科向日葵属宿根生草本植物。菊芋地上部分为茎叶和花，地下部分为根和块茎，菊芋中含有菊糖、酚酸、甾体、萜类、黄酮等多种生物活性成分，具有控制血糖、免疫调节和抗肿瘤等多种作用[3]。菊芋块茎可用于生产低聚果糖、菊糖，制成菊芋干、熬粥等，菊芋也常用于腌制泡菜、酱菜[4]。

本文主要以菊芋为原料，将具有抗菌活性的嗜酸乳杆菌LL、乳酸乳球菌LA分别单独应用于泡菜发酵，研究发酵时间、发酵温度、接种量、加糖量对嗜酸乳杆菌LL、乳酸乳球菌LA单独发酵的影响，探讨抗菌性乳酸菌发酵在泡菜生产中的应用，实现菊芋泡菜的安全生产。

1 材料和方法

1.1 材料

食盐、白砂糖：食品级，市售；菊芋：郑州附近种植地新鲜采收。

嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL：郑州轻工业大学食品新产品新技术创新实验室保藏。

大肠杆菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)：上海鲁微科技有限公司。

MRS培养基：杭州百思一基生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SHP-250智能生化培养箱上海鸿都电子科技有限公司；LX-C35L灭菌锅合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YP20001电子天平上海光正医疗仪器有限公司；UV-5500分光光度计上海元析仪器有限公司。

1.3 发酵菊芋的制备

1.3.1 工艺流程

新鲜菊芋→清洗→晾干→切片→加入辅料→混匀→接种→发酵→成品。

1.3.2 菊芋的发酵

配制番茄-黄豆芽-菊芋培养液[5,6]：称取20 g番茄，20 g黄豆芽，10 g菊芋，加入1 L水煮30 min，过滤后加入20 g葡萄糖，搅拌溶解，补水定容至1 L，灭菌，冷却后备用。

将嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL分别接入MRS肉汤培养基活化后，按接种量2%(体积分数)，分别转接到番茄-黄豆芽-菊芋培养液中培养24 h，作为乳酸菌种液。

香辛料液：盐80 g/L，高良姜10 g/L，生姜10 g/L，二荆条10 g/L，花椒1 g/L。

新鲜菊芋清洗、晾干、切片，按香辛料液∶菊芋为1∶1的比例倒入香辛料液，按比例加入白糖、食盐，拌匀，接种乳酸菌种液。分别考察发酵温度、接种量、加糖量、发酵时间等对发酵菊芋的影响。发酵期间定期取样测定总酸含量(以乳酸计)、亚硝酸盐、氨基酸态氮等指标。

1.3.3 总酸含量的测定

参考GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》。

1.3.4 亚硝酸盐含量的测定

参考GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.3.5 氨基酸态氮含量的测定

参考GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》。

1.3.6 抑菌性的测定

将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌转接至营养肉汤培养基，37 ℃培养16～18 h后，以10000 r/min离心15 min，生理盐水洗涤，制备菌悬液，调整菌液浓度至106CFU/mL。将15 mL琼脂(1.8%)培养基倒入灭过菌的培养皿中，静置，凝固，作为下层。将冷却至50 ℃左右的营养琼脂培养基倒入已经凝固的下层平板上，作为上层。取0.2 mL大肠杆菌菌悬液(106CFU/mL)涂布平板，涂布均匀。将灭菌牛津杯(Φ7.8 mm)均匀放置在培养基上，使其与培养基无缝隙[7]。取200 μL待测液于牛津杯中，37 ℃培养16～18 h，观察抑菌情况，采用游标卡尺测定抑菌圈直径。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性

嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL为实验室前期采用牛津杯法筛选出的具有抗菌活性的菌株。以大肠杆菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)为检验菌，测定嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL对大肠杆菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)的抑菌性，结果见表1。

表1 乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性Table 1 The antibacterial activity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

由表1可知，嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL对大肠杆菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)具有抑菌性。

2.2 温度对菊芋发酵的影响

按香辛料液∶菊芋为1∶1(质量比)的比例，将菊芋、香辛料液倒入泡菜坛中，加入白砂糖10 g/kg，分别接种嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL种液50 g/kg，将菊芋片分别在室外(5～15 ℃)、室温(25 ℃)、30 ℃、34 ℃、37 ℃条件下发酵，发酵7，14 d时取样测定发酵液中总酸(以乳酸计)含量、氨基酸态氮含量及菊芋片中亚硝酸盐含量，结果见图1～图3。

2.2.1 不同温度发酵菊芋时总酸含量变化

不同发酵温度时菊芋发酵液总酸含量(以乳酸计)见图1。

图1 发酵温度对菊芋发酵液总酸的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on total acids of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图1中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵，总酸含量(以乳酸计)在发酵温度30 ℃以上时增长均较快，发酵7 d后总酸含量变化不大，其中在30～37 ℃，总酸含量均在12 g/L以上。由图1中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，室温以上发酵时，总酸含量增加较快。在发酵温度较低(室外15 ℃以下)时，嗜酸乳杆菌LL、乳酸乳球菌发酵液的总酸含量增长缓慢。结果表明，温度在30～37 ℃，嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL生长产酸较快。

2.2.2 不同温度发酵菊芋时亚硝酸盐含量变化

采用嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL在不同发酵温度时菊芋片中亚硝酸盐含量见图2。

图2 发酵温度对菊芋亚硝酸盐含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on nitrite content of Jerusalem artichoke

由图2中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵，菊芋片中亚硝酸盐含量在发酵7 d时较高，发酵14 d时下降。对比不同发酵温度时亚硝酸盐含量，发酵7 d时，34 ℃发酵亚硝酸盐含量最低。由图2中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，发酵7 d时室外低温发酵亚硝酸盐含量最高，发酵14 d时亚硝酸盐含量降低或不再明显变化。总体来说，采用乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌单独发酵，亚硝酸盐含量均符合国标限量要求，发酵14 d时亚硝酸盐含量均低于5 mg/kg。

2.2.3 不同温度发酵菊芋时发酵液中氨基酸态氮含量变化

分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL在不同温度发酵菊芋时发酵液中氨基酸态氮含量见图3。

图3 发酵温度对菊芋发酵液中氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图3中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵，发酵温度低于37 ℃时，随着时间延长，氨基酸态氮有所增加，37 ℃发酵时，在发酵7 d后，氨基酸态氮含量不再明显改变。由图3中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，当发酵温度高于室温25 ℃时，随着发酵时间延长，发酵液中氨基酸态氮含量增加，低于室温(室外)发酵时，氨基酸态氮含量变化较小。其中，发酵温度在34～37 ℃时，发酵液中氨基酸态氮含量增长较快。

对比不同温度发酵时总酸含量(以乳酸计)、亚硝酸盐含量、氨基酸态氮含量，采用嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL分别发酵，发酵温度在30～37 ℃，发酵7 d时，总酸含量不再明显增加。采用嗜酸乳杆菌LA发酵，亚硝酸盐含量在发酵7 d时较高，在发酵14 d时，亚硝酸盐含量降低至3.1 mg/kg以下；采用乳酸乳球菌LL高于室温发酵，发酵7 d后，亚硝酸盐含量基本不再明显改变。其中，采用嗜酸乳杆菌LA发酵7 d，产酸较快且亚硝酸盐含量较低的发酵温度为34 ℃；采用乳酸乳球菌LL发酵7～14 d，产酸较快且亚硝酸盐含量较低的发酵温度为37 ℃。随着发酵时间的延长，室温发酵时，亦能达到比较理想的效果。

2.3 接种量对发酵的影响

按香辛料液∶菊芋为1∶1(质量比)的比例，将菊芋、香辛料液倒入泡菜坛中，加入糖10 g/kg,分别接种嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL，接种量分别为0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%(质量分数)，34 ℃发酵7，14 d时取样测定发酵液中总酸(以乳酸计)含量、菊芋片中亚硝酸盐含量及氨基酸态氮含量，结果见图4～图6。

2.3.1 不同接种量对总酸含量的影响

接种量对嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL分别发酵菊芋时的影响见图4。

图4 接种量对菊芋发酵液总酸含量的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on total acid content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图4中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵时，发酵7 d时，接种量在0.2%～10%(质量分数)时总酸含量均在12 g/L以上，各组间相差不大，其中接种量2%(质量分数)时总酸含量最大，为12.94 g/L。由图4中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，接种量在2%～15%(质量分数)时总酸含量较高，其中接种量10%(质量分数)时总酸含量最大，发酵7 d时为12.94 g/L。但对比不同接种量接种后发酵7 d时发酵液中总酸，基本在11～13 g/L间波动，相差不大。接种量主要影响总酸含量达到峰值的时间，随着发酵时间的延长，各组间的差异变小。

2.3.2 不同接种量对亚硝酸盐含量的影响

分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵菊芋片中亚硝酸盐含量见图5。

图5 接种量对菊芋亚硝酸盐含量的影响Fig.5 Effect of inoculation amount on nitrite content of Jerusalem artichoke

由图5可知，发酵7 d后，随着发酵时间延长，总体来说，亚硝酸盐含量呈下降趋势或不再明显变化。由图5中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵，接种量为5%时，亚硝酸盐含量最低。由图5中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵7～14 d时，接种量5%时亚硝酸盐含量均较低。

2.3.3 不同接种量对氨基酸态氮的影响

分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵菊芋，接种量对菊芋发酵液中氨基酸态氮含量的影响见图6。

图6 接种量对菊芋发酵液中氨基酸态氮含量的影响Fig.6 Effect of inoculation amount on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图6可知，随着发酵时间延长，发酵液中氨基酸态氮含量增加，但在发酵7 d后，增长幅度不大。其中采用嗜酸乳杆菌LA(见图6中(1))和乳酸乳球菌LL(见图6中(2))分别单独发酵，发酵7 d、接种量0.5%(质量分数)时氨基酸态氮含量最高；与乳酸乳球菌LL发酵相比，采用嗜酸乳杆菌LA发酵时，发酵液中氨基酸态氮含量要略高一些。

综合考虑总酸含量、亚硝酸盐含量，采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL分别发酵，均为接种量5%时产酸较快且亚硝酸盐含量较低。

2.4 加糖量对发酵的影响

按香辛料液∶菊芋为1∶1(质量比)的比例，将菊芋、香辛料液倒入泡菜坛中，加白砂糖量0～25 g/kg，分别接种乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA 5%(质量分数)，34 ℃发酵7，14 d时取样测定发酵液中总酸(以乳酸计)含量、菊芋片中亚硝酸盐含量及氨基酸态氮含量，结果见图7～图9。

2.4.1 加糖量对总酸含量的影响

加糖量对分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵菊芋后发酵液中总酸含量(以乳酸计)的影响见图7。

图7 加糖量对菊芋发酵液总酸含量的影响Fig.7 Effect of sugar content on lactic acid content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图7中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵，与发酵7 d相比，发酵14 d时总酸含量略有增加，但变化幅度不大；由图7中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，发酵7 d后，总酸含量无明显增加，基本稳定。其中，采用嗜酸乳杆菌LA发酵时总酸含量要略高于采用乳酸乳球菌LL发酵。菊芋发酵过程中加入一定的糖主要是为了促进乳酸菌的增殖培养，由图7可知，加糖量在0～25 g/kg时，随着糖添加量的增加，总酸含量并无明显增加，各组间总酸含量(以乳酸计)相差不大，说明加糖量控制在0～25 g/kg时，对成品的总酸含量影响不大，嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL对蔗糖利用及转酸能力较弱。

2.4.2 加糖量对亚硝酸盐含量的影响

不同加糖量时分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵后，菊芋片中亚硝酸盐含量见图8。

图8 加糖量对亚硝酸盐含量的影响Fig.8 Effect of sugar content on nitrite content of Jerusalem artichoke

由图8中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌发酵，加糖量在0～10 g/kg时，发酵7 d时亚硝酸盐含量较高，14 d时亚硝酸盐含量下降，加糖量在15～25 g/kg时，亚硝酸盐含量在14 d时略有增加，在发酵14 d时，糖含量较高时亚硝酸盐含量也略高；其中，加糖量5 g/kg时，亚硝酸盐含量在7～14 d时均较低。由图8中(2)可知，采用乳酸乳球菌发酵，加糖量在5～10 g/kg时，亚硝酸盐含量相对较低，发酵7 d后，多数情况下亚硝酸盐含量随时间延长略有下降，其中加糖量5 g/kg时，亚硝酸盐含量最低。总体来说，采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵，各组之间亚硝酸盐含量相差不大，发酵7，14 d时菊芋片中亚硝酸盐含量基本在2～4 mg/kg。

泡菜中亚硝酸盐的形成主要与含有硝酸还原酶的细菌密切相关，大肠杆菌、摩根氏变形杆菌等有害杂菌都能加速亚硝酸盐的形成[8]。泡菜中的革兰氏阴性菌属于硝酸盐还原阳性菌。乳酸乳球菌LL和嗜酸乳杆菌LA除发酵产酸外，对大肠杆菌等具有一定的抑菌性，测定不同发酵温度、不同接种量及不同加糖量各组中亚硝酸盐含量，可知在25～34 ℃发酵时，发酵7 d，亚硝酸盐含量低于7 mg/kg；发酵14 d，亚硝酸盐含量低于5 mg/kg。根据食品安全国家标准GB 2762—2017《食品中污染物限量》，蔬菜及其蔬菜制品包括腌渍蔬菜中亚硝酸盐含量(以NaNO2计)限量要求低于20 mg/kg。菊芋发酵后7 d，亚硝酸盐含量符合国标要求，从食用安全性来看，适当延长发酵期更有利于亚硝酸盐的清除。

2.4.3 加糖量对氨基酸态氮含量的影响

不同加糖量时，分别采用嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL发酵菊芋片后发酵液中氨基酸态氮含量见图9。

图9 不同加糖量对菊芋发酵液中氨基酸态氮含量的影响Fig.9 Effect of different sugar content on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由图9可知，发酵7 d后，随着发酵时间延长，氨基酸态氮含量略有增长。由图9中(1)可知，采用嗜酸乳杆菌LA发酵时，加糖量在10～20 g/kg时，氨基酸态氮含量较高。由图9中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL发酵时，各组间氨基酸态氮含量相差不大；且与采用乳酸乳球菌发酵相比，采用嗜酸乳杆菌发酵后，发酵液中氨基酸态氮含量更高。

发酵温度、接种量、加糖量等因素主要影响发酵初期菌种的增殖期，是否能促进菌种快速增殖到所需数量，发酵总酸含量到达高峰的时间。其中，发酵温度为30～37 ℃时更有利嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL的生长产酸。采用嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL发酵时，发酵过程中适当地加入白砂糖可以起到调节口感的作用，但白砂糖的加入并不能有效促进其增长、产酸。从促进乳酸菌增殖、加快产酸方面来看，发酵过程中适当地补入葡萄糖效果可能会更好。菊芋泡菜总酸含量、亚硝酸盐含量、氨基酸态氮含量一方面取决于原料本身，另一方面主要受发酵时间的影响。低温发酵延长了泡菜到达所需酸度的时间，从另一方面说明低温保藏有利于其风味稳定。