针刺捻转补泻手法对自发性高血压大鼠海马-HPA轴的影响及其降压机制*

孙 娇，梁靖蓉，曾天笑，郝晓敏，黄佩怡，刘清国

(北京中医药大学，北京 100029)

原发性高血压(Essential hypertension,EH)是一种临床常见、高发的慢性疾病。2018年最新修订的《中国高血压防治指南》指出，我国人群高血压的患病率仍呈升高趋势，知晓率、治愈率和控制率分别为51.6%、45.8%和16.8%，总体仍处于较低水平[1]。除此之外，高血压可导致心、脑、肾重要器官损伤，严重者可致死或致残，因此防治高血压、保护靶器官具有重要意义。研究表明，针刺治疗高血压效果显著，施以捻转补泻手法在降压的同时可以通过不同生物学途径起到脏器保护作用[2-5]。然而，针刺治疗高血压的中枢机制研究较少，需要深入挖掘其相关机制。在中枢各靶脑区中，海马在高血压初始阶段即出现功能紊乱、形态改变等病理变化[6]，并且相关研究表明海马对下丘脑-垂体-肾上腺皮质( Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex,HPA)轴具有抑制作用，从而产生降压作用[7],且海马中糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，GR)在对HPA轴调控中起到关键作用[8]。因此，本研究通过观察自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)针刺捻转补泻手法干预下海马形态变化、GR及HPA轴各组分，即皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)表达的影响，探讨针刺捻转补泻手法调控血压的中枢-外周机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级自发性高血压大鼠(SHR)48只，WKY大鼠16只，均为雄性，9周龄，体质量(220±30)g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均给予常规饲料饲养，自由饮食和进水。适应性喂养1周后，采用完全随机数字表法，将48只SHR等分为模型组、针刺补法组、针刺泻法组，每组16只，16只WKY大鼠作为空白组。所有实验操作均按照世界卫生组织“涉及动物生物医学研究国际指导原则”进行，并经北京中医药大学动物保护与使用委员会批准(批准号：BUCM-4-2018061501-2058)。

1.2 仪器与试剂

中研太和牌针灸针(规格：0.18 mm×13 mm，北京中研太和医药有限公司)；ACX-XM计重电子秤(上海升亮电子科技有限公司)；无创血压仪(BP-6，成都泰盟科技有限公司)；显微镜(自动化智能型正置研究级显微镜，BX53,日本奥林巴斯)；高速冷冻离心机(20PR-52D,日本日立)；全自动多功能酶标仪(MULTISKAN MK3，Thermo公司)；电热恒温培养箱(DH4000A，天津泰斯特)；自动洗板机(thermo，USA)；酶联免疫试剂盒(货号：E02G0359、E02A0005、E02C0372、E02C0008，BG公司)。

1.3 针刺干预

针刺各组均取“太冲穴”(双侧)，于后肢足背1、2趾骨间凹陷处取“太冲穴”，取穴参照《实验针灸学》教材[9]。针刺操作由同一人于每日下午2：00—4：00操作完成。具体操作：①捻转补法组：以右手为刺手，直刺双侧太冲穴1～2 mm，行捻转补法，持续3 min，留针20 min,持续针刺15 d。②捻转泻法组：以右手为刺手，直刺双侧太冲穴1～2 mm，行捻转泻法，其余操作同捻转补法组。③空白组与模型组：每日只进行与针刺各组相同的抓捉、固定，并维持20 min。持续15 d。

1.4 指标检测方法

1.4.1 血压测量 各组大鼠适应性喂养1周后，在室温(22±2)℃条件下，将清醒状态下的大鼠置于专用鼠笼中，暴露其尾部，调节温控器恒定约36℃，用无创血压仪测量大鼠尾动脉收缩压，连续测量3次，取其均值。于针刺前1 d，针刺后第3、6、9、12、15 d测量血压。

测量血压注意事项：①无创血压仪应提前预热，大鼠置于鼠笼中不超过15 min，避免因加热时间过长而致缺氧死亡；②操作时动作宜轻柔，环境应保持安静，避免激惹大鼠，以免因操作不当而影响血压;③每次测量血压时间应保持一致，于上午8:00—12:00完成测压。

1.4.2 HE染色观察海马形态学变化 针刺治疗结束后，各组随机取6只大鼠，用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，进行甲醛灌注。大鼠断头取下海马，移入4%、4℃多聚甲醛固定24 h，修块后充分水洗、脱水、石蜡包埋切片，HE染色后，光镜下观察海马组织病理变化。

1.4.3 ELISA法检测海马GR、HPA轴各组分含量表达变化 将每组剩余10只大鼠，在10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉状态下断头，腹主动脉取血，断头取海马。经4℃ 0.9%氯化钠溶液漂洗后，滤纸吸干，在冰浴中制成匀浆，4℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液。采用ELISA法测定海马组织GR、血浆促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)的变化，操作程序严格按说明书进行。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后收缩压比较

与空白组比较，其它各组大鼠尾动脉收缩压在针刺前及针刺后15 d均显著升高(P<0.01)。与模型组比较，治疗第6天，泻法组收缩压明显下降(P<0.05)；治疗第9天，补法组收缩压明显下降(P<0.05)，泻法组收缩压显著下降(P<0.01)；治疗第15天，补法组收缩压显著下降(P<0.01)。与补法组比较，治疗第12天，泻法组收缩压明显更低(P<0.05)；治疗第15天，泻法组收缩压显著更低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后尾动脉收缩压比较

2.2 各组大鼠海马CA1区病理学变化

HE染色结果显示，空白组神经元结构完整，细胞形态规则，细胞间隙正常，核仁清晰；模型组染色变浅，神经元萎缩，排列疏松，出现核固缩；补法组神经元丢失，细胞形态改变，部分细胞结构退化；与补法组比较，泻法组神经元较紧密，核仁清晰，细胞结构较完整。见图1。

图1 各组大鼠海马CA1区病理学变化(HE,400×)

2.3 各组大鼠海马GR变化

与空白组比较，模型组大鼠海马GR的表达明显升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，补法组和泻法组大鼠海马GR表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与补法组比较，泻法组海马GR表达降低更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。总体结果显示，各组大鼠海马GR表达由小到大依次为空白组<泻法组<补法组<模型组。见图2。

图2 各组大鼠海马GR变化

2.4 各组大鼠HPA轴各组分含量变化

与空白组比较，模型组大鼠血浆ACTH、CORT、CRH均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，补法组和泻法组大鼠ACTH、CORT、CRH均明显下降(P<0.05或P<0.01)；与补法组比较，泻法组大鼠ACTH、CRH下降更明显(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠HPA轴各组分含量变化

3 讨论

自发性高血压大鼠(SHR)被认为是研究高血压理想的动物模型，与人类高血压发病极其相似[10]。通过对SHR大鼠证侯特征进行研究发现，SHR大鼠与正常大鼠比较，具有肝阳上亢的表现，与人类原发性高血压疾病肝阳上亢证较为接近，表现为易激惹、烦躁等特征[11]。“太冲穴”为肝经原穴，针刺太冲穴可以起到平肝潜阳作用。此外，《灵枢·经脉》记载：“肝足厥阴之脉……上出额，与督脉会于巅”，故肝脑相通，这为本实验研究高血压中枢降压机制提供理论依据。因此本实验选用针刺SHR大鼠双侧太冲穴的干预方法，并根据其发病特征，研究相关降压机制。

由于高血压的影响，SHR脑组织形态会逐渐发生病理改变，且随血压升高而不断加重[12]。高血压初始阶段，SHR即出现海马区功能紊乱、形态改变、神经元丢失等病理变化[13]。SHR大鼠易激惹，可导致HPA轴功能亢进，产生皮质醇(CORT)类糖皮质激素导致海马损伤。而海马又是HPA轴的高位调节中枢，海马中糖皮质激素受体(GR)具有兴奋HPA轴作用[14]，从而引起血压升高。通过减少CORT产生，可减轻海马损伤[8]，同时降低血压。此外，GR与糖皮质激素结合，还可促进血管平滑肌细胞增殖, 血管阻力增加, 血压上升[15]。在HPA轴的调节过程中，当下丘脑接受高位中枢信息时，可合成和分泌促垂体肾上腺皮质释放激素(CRH),CRH作用于垂体可使其分泌肾上腺皮质激素(ACTH),ACTH使肾上腺皮质分泌皮质醇(CORT)[16]。CORT又可加强去甲肾上腺素对心血管收缩、提高心搏出量和左心指数，使血压升高[17]。

因此，本实验以海马为切入点，以不同针刺捻转补泻手法针刺SHR大鼠双侧太冲穴为干预手段，运用HE染色及Elisa实验方法，观察捻转补泻手法对海马形态、GR及HPA轴各组分表达的影响，探讨捻转补泻手法调控血压的中枢-外周降压机制。本研究结果显示：①针刺捻转补泻手法能明显降低SHR血压，且捻转泻法降压效果更显著;②HE染色提示针刺捻转补泻手法能减轻SHR大鼠海马组织损伤，对海马神经元起到保护作用;③针刺捻转补泻手法可以通过减少GR表达，从而抑制HPA轴各组分表达，达到降压效果。综上，笔者推断针刺捻转补泻手法可以通过良性调控海马GR及HPA轴各组分表达，达到降压作用，这可能是中枢-外周降压机制之一。