毛竹四倍体诱导及初步鉴定*

徐鹏飞 杨艳红 张毓婷 陈 云 汤定钦

(浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室 杭州 311300)

毛竹(Phyllostachysedulis)是一种大型的多年生常绿散生竹类，具有生长快、繁殖强、成材早、用途广、投资少收益大等特点。据全国第八次森林资源清查统计(国家林业局， 2014)，目前我国竹林面积601万hm2，其中毛竹林443万hm2，毛竹在竹林面积中所占比例巨大。在针对毛竹的研究中，遗传育种是相对薄弱的环节，原因在于毛竹开花间隔周期长达60年以上，期间以无性繁育构建了克隆群体，这限制了人们对其遗传基础的研究，难以进行选择、杂交育种等多世代的遗传改良。我国毛竹林在世界竹业发展中占据重要地位，发展毛竹林是发展林业的重大措施，随着我国竹产业的迅猛发展，竹子资源利用还面临不少问题，其中最为突出的是新品种的缺乏，无法满足竹产业快速发展的需求。

多倍化对植物进化与新物种形成具有重要的意义，是选育新品种的重要手段之一。研究结果表明： 多倍体植株是由于染色体的加倍而成，其根、茎、叶、花、果实等多表现出增大、活性成分含量提高，植株抗逆性增强等显著特征。药用植物杭白芷(Angelicadahurica) 多倍体含有的欧前胡素比正常植株高2倍(彭菲等， 2002)； 白术(Atractylodesmacrocephala) 四倍体过氧化物含量比二倍体植株明显增加(程心文等， 2003)； 甜叶菊(Steviarebaudiana) 四倍体叶片中糖甙含量比二倍体增加4.9%(陈绍潘，1995)； 四倍体西瓜(Citrulluslanatus) 耐盐性明显比二倍体强(刘文革等， 2002)； 四倍体青菜(Brassicachinensis) 的耐热性要高于二倍体植株(张建军等，1998)。迄今竹子多倍体的诱导仅见通过流式细胞仪等方法在花药离体培养中鉴定出了丛生竹种麻竹(Dendrocalamuslatiflorus) 六倍体、十二倍体植株(李海营等， 2011)，散生竹未见报道。

植物多倍体人工诱导方法可分为物理诱导与化学诱导。物理诱导方法由于诱导率低、效果不稳定等因素已逐渐不被采用(陶抵辉等， 2007)。常用于化学诱导的试剂有各种植物碱、麻醉剂、生长剂、激动素、抗生素等，其中秋水仙素是诱变多倍体效果最好的药剂之一(彭静等， 2010)，常见的诱导法有浸泡法、滴液法和混培法等(杜艳伟等， 2011)。秋水仙素抑制了细胞有丝分裂时期纺缍丝的合成，因而在其后期染色单体分裂时没有纺缍丝向细胞两极牵引而不能形成细胞板，细胞不分裂就形成了染色体加倍的细胞(Soltisetal.， 1989)。因此，利用秋水仙素诱导植物多倍体多选择处理有丝分裂的细胞，如茎尖、根尖、幼叶、顶芽等这些分裂最旺盛的植物组织(Wuetal., 2015)，其中种子诱导率和存活率均显著高于茎尖和愈伤组织(Ainaetal., 2012)。研究表明： 0.5 g·L-1的秋水仙素水溶液浸渍甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)种子12 h，诱导率达到23.0%(莫官站等， 2010)，1 g·L-1的秋水仙素溶液浸渍萌动的有斑百合(Liliumconcolorvar.pulchellum)种子，诱导率高达44.4%(张锡庆等， 2017)。

本研究以毛竹种子为材料，研究不同秋水仙素浓度及时间处理对毛竹染色体加倍的效果，并观察毛竹多倍体早期的性状表现，以期建立一套高效的毛竹多倍体诱导及快速、准确的倍性鉴定方法，为毛竹新品种选育提供优新种质资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料及预处理

毛竹种子于2017年9月采自广西壮族自治区灵川县同一母株，半同胞种子在其种胚完成发育、后熟后采收。在不伤害到胚的前提下剥去种壳，筛选出发育饱满的种子。在超净工作台中利用70%(V/V)的乙醇种子表面消毒30 s、无菌水漂洗3次，再用2%(V/V)次氯酸钠溶液浸泡种子10 min、无菌水漂洗3次后，用质量分数0.1%的GA20溶液浸泡种子24 h进行催芽。

1.2 多倍体诱导方法

经预处理的毛竹种子，分别用质量浓度0.1、0.5、1、2 g·L-1的秋水仙素(国药集团化学试剂有限公司)溶液诱导处理24、48、72 h，无菌水为空白对照，每组处理30粒种子，各设3个重复。处理结束后，用无菌水洗3～4次，滤纸挤干水分，接种到经无菌处理的培养皿滤纸上培养。待种子露白，观察记录种子下胚部膨大情况后，再将露白的种子播种于土壤培养穴中。设置培养箱的培养条件为： 温度(25±1)℃，光照强度2 000 lx，光周期12 h光照/12 h 黑暗。

1.3 流式细胞仪测定DNA相对含量

生物体的单倍体基因组所含 DNA 总量称为C值。在植物学研究中，流式细胞仪(flow cytometry，FCM)可用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性水平，计算公式： 待测样本核DNA含量或倍性水平=参照样本核DNA含量或倍性水平×(待测样本G0或G1荧光均值/参照样本G0或G1荧光均值)(Dolezeletal., 2007)。

待毛竹幼苗长至七叶一心期开始分蘖后，按CyStain UV Precise T 试剂盒(Sysmex Partec, 德国)操作说明，在培养皿中加入450 μL的Nuclei Extraction Buffer，以刚抽出未展开的幼嫩叶片为材料，用刀片迅速切碎以保证细胞充分释放，静置3 min使其与细胞提取液充分结合后，加入1 800 μL染色液， 200目细胞筛过滤后，静置5 min，在流式细胞仪(CYHOW PA，德国PARTEC)上进行检测，参数按常规的设定。其中，每株上母株和侧枝的嫩叶都要测，并且每个样重复测3次。测定每个样品时，先用水稻‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)进行校对后才开始测定； 同时每次的倍性筛选时选择‘日本晴’和二倍体毛竹作为对照，以提高所得结果的可靠性。诱导率=多倍体植株数量/诱导处理种子数量。

1.4 气孔密度和保卫细胞大小测定

待植株生长6个月后，分别选取3株长势良好的四倍体与二倍体植株，截取与对照二倍体植株相同位置成熟叶片的中部，使用次氯酸离析法(张立荣等， 2009)制片，每个植株随机选10个视野和10个气孔拍照， 20倍物镜下观察统计。

1.5 光合作用的测定

待植株生长8个月后，参照吴海燕等(2019)方法，于晴天9∶00—11∶00，选取长势良好的3株二倍体与四倍体植株，然后每株选取从顶端起第3片成熟叶子，每个叶子采用LI-6400光合仪(Li-COR, 美国)测定，重复3次，使用自然光，温度(25± 2)℃。

1.6 植株形态测定

毛竹幼苗在培养穴中生长30天后，将四倍体和二倍体毛竹幼苗炼苗移栽至大棚中,生长60天后，分别选取长势健壮的四倍体和二倍体毛竹各5株，对株高、叶片大小等进行观察记录。

叶长(cm)： 叶片基部到叶尖的长度，测量每株竹苗从顶端起的第3个成熟叶片。

叶宽(cm)： 叶片最宽部分的横向长度，测量每株竹苗从顶端起的第3个成熟叶片。

株高(cm)： 母株顶端到地面的距离。

1.7 统计分析

采用 SPSS17.0 软件对数据进行统计分析，Duncan法进行显著性差异分析。

2 结果与分析

图1 不同倍性毛竹植株流式细胞仪检测结果

2.1 多倍体植株的鉴定

由于植物多倍体中的细胞含有倍增的染色体数，其细胞中的总DNA含量也相应地倍增,通过流式细胞仪可以较为简便地实现多倍体的鉴定。首先从已知的水稻的C值数据库(http:∥www.ricedata.cn/variety/)查得‘日本晴’DNA含量为2C=1 pg，而后利用公式计算待测样品的C值=(待测样品的平均峰值÷‘日本晴’水稻的平均峰值)×1 pg。由图1可知，水稻‘日本晴’的DNA含量峰值位于13道的位置左右，二倍体毛竹DNA含量其峰值约为50道,四倍体植株的DNA含量峰值位于100道的位置左右，说明诱导得到的植株细胞核DNA含量有成倍增加，通过C值的换算公式，可以确定为四倍体。如果DNA含量在50与100道处都有峰值，则表明植株为混倍体(王丽艳等， 2004； 张虹等， 2017)。分别用0.1、0.5、1、2 g·L-14种不同浓度的秋水仙素溶液浸泡经预处理的毛竹种子24、48和72 h后，诱导结果见表1。诱导处理1 080粒毛竹种子，栽培后共得到204株植株，其中具有下胚轴膨大现象的种苗有92株(图2)，经流式细胞仪检测倍性，除去出现双峰的混倍体植株，共获得15株四倍体植株。由表1可知，当秋水仙素浓度为0.5 g·L-1、处理时间为72 h，及秋水仙素浓度为1 g·L-1、处理时间为24 h时，四倍体的诱导率分别达4.44%和5.56%，诱导效果最佳。而用低于0.1 g·L-1浓度的秋水仙素处理种子时无明显诱导效果，说明诱导毛竹多倍体需要一定的秋水仙素浓度。当秋水仙素浓度≥2 g·L-1，随着浸泡作用时间增长，植株的存活率及多倍体诱导率都明显下降。

表1 不同秋水仙素处理组合对毛竹种子四倍体诱导的影响①

图2 经秋水仙素处理后毛竹种子生长期下胚轴膨大现象

2.2 叶片保卫细胞大小及密度观察

已有的研究结果表明，气孔、保卫细胞、运动细胞的大小和叶绿体数目与倍性成显著正相关，气孔密度与倍性成显著负相关(张红亮等， 2012)。经过观察对比发现(表2，图3)，诱导成的四倍体毛竹的叶下表皮气孔保卫细胞显著大于二倍体植株(P<0.05)，并且叶下表皮气孔密度显著小于二倍体植株(P<0.05)。这也从细胞形态结构的角度证实了诱导的四倍体植株的真实性。

表2 毛竹二倍体与四倍体植株气孔大小及密度的比较

图3 毛竹二倍体与四倍体气孔保卫细胞

2.3 不同倍性毛竹光合速率的差异

毛竹四倍体植株的光合速率高于二倍体，大约是二倍体植株的1.21倍(图4)，说明染色体加倍的毛竹植株在光合特性方面要优于普通的二倍体植株。

图4 不同倍性毛竹叶片的光合速率

2.4 不同倍性植株形态比较

与二倍体对照相比，四倍体植株表现为植株健壮、株高增高(图5A、C)，叶片长度和宽度都有所增加(图5B、D、E)

图5 毛竹二倍体与四倍体的形态特征

3 讨论

Winkler(1916)在研究龙葵(Solanumnigrum)嫁接时从其愈伤组织得到了四倍体植物，首先引入了多倍体这一概念。Blakeslee等(1937)首次发现用秋水仙素诱导多倍体的方法，此方法已经在经济作物、观赏植物、药用植物等方面得到了广泛的运用。目前对植物进行多倍体诱导是获取新品种的最有效育种方法之一(Kunitakeetal.， 1998； 蒋淑磊等， 2015； 张宏宇等， 2019)。

研究表明，只有在一定浓度范围以及合适的处理时间内，秋水仙素才可以有效地诱导植物多倍体的发生。秋水仙素的毒性作用与使用的浓度和处理时间成正比，往往认为秋水仙素浓度接近于半致死浓度时，诱导多倍体效率最高(罗静等， 2005)。秋水仙素诱导浓度过低，其对植物材料的诱导效果就不明显，并且产生混倍体的几率也就越大。适宜的处理时间可以使足够的药量进入诱导材料的细胞内而且又不伤害细胞本身，处理时间过短则可能造成秋水仙素无法完全作用于植物材料，处理时间过长则可能对植物材料产生较大的毒害作用，增加其死亡率。

本研究参考了相关文献，也经过大量的前期试验验证，浓度从7、6、5、4、3、2、1 g·L-1到0.1 g·L-1，时间从8、12、24、48 h到72 h，每个梯度都做过尝试，最终发现在秋水仙素浓度超过5 g·L-1时对毛竹的致死率几乎是百分之百，而低浓度短时间处理其效果不明显。因此，在经过反复的试验后，最终确定了处理浓度(0.1、0.5、1、2 g·L-1)和时间(24、48、72 h)的组合，并且在后续的试验中也验证了这个组合是比较理想的，特别是在浓度0.5 g·L-1处理48 h以上和1 g·L-1处理12 h以上都诱导出了四倍体。在关于秋水仙素诱导植物多倍体中，诱导出的植株以三倍体和四倍体居多，如三倍体西瓜(豆峻岭等， 2015)、四倍体桑(Morusalba)(Chakrabortietal., 1998)等，也有八倍体和十二倍体，如八倍体柳枝稷‘京稷31’(Panicumvirgatum)(吴海燕等， 2019)、十二倍体罗田甜柿(Diospyroskaki)(谷晓峰等， 2003)。虽然本研究仅成功诱导出15株四倍体毛竹，但这无疑为毛竹育种增加了新的种质资源。

植物多倍体的直接的鉴定方法通常分为染色体计数和细胞DNA含量测定等(王丽艳等， 2004； 费希同等， 2014)。其中，通过流式细胞仪测定细胞中的DNA总量，这种方法不仅具有快速、简便、准确等优点，还能够检验出混倍体(王丽艳等， 2004； 张虹等， 2017)。细胞学和形态学特征，如气孔的密度及其保卫细胞的大小(Abaketal., 1998; Becketal., 2003)、植株的高生长和光合效率等(Liuetal., 2007; Tangetal., 2010)，也被用于倍性测定的间接指标。由于毛竹染色体数量较多(陈瑞阳等， 2003)，笔者在对多倍体毛竹进行鉴定时，主要采用流式细胞仪测定法，并通过该方法鉴定了15株四倍体； 在这基础上，通过比较二倍体和四倍体间气孔密度及保卫细胞的大小、植株的高生长和叶片的光合效率等细胞学和形态学特征，发现毛竹四倍体确实发生了“巨大化”现象(韦荣昌等， 2013； 洪陈洁等， 2014)，这也间接地证实了获得毛竹四倍体的可靠性。

4 结论

多倍体的诱导是重要而高效的植物育种技术，但迄今还没有关于人工诱导毛竹同源多倍体的报道。本研究利用秋水仙素对毛竹种子进行多倍体诱变处理，经流式细胞仪检测等方法对处理后的植株进行DNA相对含量测定，结果表明共获得15株四倍体毛竹。秋水仙素浓度为0.5 g·L-1、处理时间为72 h，及秋水仙素浓度为1 g·L-1、处理时间为24 h时，诱导效果最佳。四倍体植株与二倍体植株相比，其株高增加，叶片变长增宽，光合效率也明显提升。综上，利用秋水仙素诱导处理毛竹种子可为毛竹新品种的选育提供新的种质资源。