桑葚-草莓复合果醋发酵动力学模型建立

熊亚，李敏杰*

(1.攀枝花学院 生物与化学工程学院，四川 攀枝花 617000；2.攀枝花市干热河谷特色生物资源工程技术中心，四川 攀枝花 617000)

桑葚，为桑科植物桑树的果穗。现代研究证实，桑葚果实中含有丰富的活性蛋白、维生素、氨基酸、胡萝卜素、白藜芦醇、花青素等成分，具有多种功效，被医学界誉为“21世纪的最佳保健果品”[1-5]。草莓属于多年生草本植物，富含维生素C、维生素A、维生素E、胡萝卜素、鞣酸、天冬氨酸、铜、草莓胺、鞣花酸与花青素等营养物质，营养价值极高[6-10]。

现今，果醋的风味和营养保健功能越来越被人们所接受和认可，人们也愈发希望能接触到品种更加多样化且具有独特风味的果醋，这种愿望缘于果醋在营养成分、口味、功效方面均要优于粮食醋[11,12]，因此复合型醋饮料及调味品具有很大的市场潜力。目前不断有各种复合果醋研制工艺的报道[13-16]，但对于果醋发酵动力学的研究还比较少[17]，草莓的香味浓颜色浅，而桑葚味淡、颜色深，两种水果形成良好的互补，不但能够弥补相互的缺陷，发挥自身的优势，满足人们对营养和保健的需求，也能够在一定程度上开拓新兴复合果醋品种市场，解决草莓、桑葚不易保存和运输的问题。本实验通过对桑葚-草莓复合果醋动力学模型的研究，对探索和优化复合果醋的优良酿造工艺，对复合果醋的市场开发及扩大化生产有着积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚、草莓：购于攀枝花学院水果超市；高活性干酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；果醋菌：烟台帝伯仕酵母有限公司；果胶酶(30万U/g)：浙江博丹衡食品配料有限公司；亚硫酸(分析纯，99.8%)、柠檬酸(分析纯)、NaOH(分析纯)：天津致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1204B电子天平 上海天平仪器厂；SZ6000B型显微镜 上海缔伦光学仪器有限公司；LB20T型手持式糖度仪 广州市铭睿电子科技有限公司；LHH-4数显电热恒温水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；0-40型酒精计 河间市宏利玻仪厂；PHS-3B精密pH计 上海圣科仪器设备有限公司；T2264MD榨汁机 上海九阳股份有限公司；722S可见光分光光度计 山东潍坊盛翔实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料预处理

将草莓和桑葚洗干净，按质量比3∶2的比例混合后榨汁。

1.3.2.2 SO2的添加

为了防止果汁被杂菌污染，在果汁中加入60 mg/L的SO2。

1.3.2.3 加入果胶酶

果胶酶的加入是为了分解果胶，增加草莓和桑葚的出汁率，水果破碎后按50 mg/L的量加入果胶酶酶解1 h。

1.3.2.4 成分调整

加入白砂糖和柠檬酸分别调节初始糖度为220 g/L，初始pH为4.5，按0.5%的加入量加入活性干酵母进行发酵。

1.3.2.5 发酵

放置于26 ℃的恒温培养箱中发酵8 d。

1.3.2.6 醋酸发酵

按0.5 g/L的添加量在酒精发酵液中加入果醋菌，放置于36 ℃的恒温摇床中进行醋酸发酵，发酵时间为10 d。

1.3.3 果醋菌菌体浓度(OD值)的测定

菌体生长量与光密度值(OD值)具有线性关系，可通过光密度值来体现菌体生长量。取一定量发酵液在570 nm波长下测定其光密度(OD值)。

1.3.4 醋酸含量的测定

利用酸碱中和滴定原理进行醋酸含量的测定。

1.3.5 酒精度的测定

酒精度采取蒸馏法测定[18]。

1.3.6 数据处理

运用Origin 8.6软件进行果醋菌菌体生长量、醋酸生成量和酒精消耗量的非线性拟合。通过回归求解动力学模型参数，建立果醋菌菌体生长、醋酸生成和酒精消耗的动力学模型方程。

2 结果与分析

由图1可知，果醋菌的生长量在发酵前3 d增长较为平缓，这是由于果醋菌代谢系统为适应新环境的需要，处于生长代谢适应阶段。从第3天开始其数量快速增长，这是因为果醋菌已适应环境，能够大量利用发酵液中的营养物质，从第8天开始果醋菌生长量变化逐渐趋于平缓，逐步进入稳定期。与果醋菌生长量变化趋势类似，发酵过程中醋酸含量在发酵前3 d变化很小，是由于果醋菌处于生长适应阶段，还未完全进行产醋酸作用。从发酵第3天开始，醋酸含量快速上升，这是因为果醋菌活性增强，开始大量繁殖，将底物转化为醋酸，导致醋酸含量大幅度上升，在发酵第10天醋酸含量达到最大值，为6.89 g/dL。从第3天开始，酒精浓度也开始急剧减少，这可能是由于果醋菌的大量繁殖导致底物酒精被大量消耗。到了第8天，酒精浓度减少趋势变缓，此时酒精浓度已经低于2%，并逐渐趋于0，这种变化趋势可能是由于酵母菌也在这一时期开始进入稳定期，并开始逐渐衰亡，底物消耗逐渐减弱，这也预示着果醋发酵基本完成。从果醋菌生长量、醋酸生成量及酒精浓度随发酵的变化上看，三者之间相互联系、相互对应。

图1 桑葚-草莓复合果醋发酵过程主要指标变化曲线Fig.1 Change curves of main indexes of mulberry and strawberry compound fruit vinegar during fermentation process

2.1 果醋菌生长动力学模型建立

由果醋菌生长量OD值的实验数据可以看出，果醋菌的生长曲线呈“S”形，因此可以用Logistic模型对发酵过程进行模拟[19]，Logistic方程由比利时数学家Verhulst首先提出，是用来表现菌体生长与营养底物之间的非线性关系的经验方程[20]，其形式为：

(1)

对式(1)积分，得到方程：

(2)

式中：y表示发酵过程中果醋菌的生长量(OD值)；A1表示初始OD值；A2表示最大生长量(OD值)；Cm表示最大比生长速率，d-1。

通过Origin 8.6软件对菌体生长量和方程式(2)进行拟合，得到A1=0.01257，A2=0.43479，Cm=0.71518，带入式(2)得果醋菌生长量随发酵过程变化的动力学模型为：

(3)

果醋菌生长量实验值与预测值模型拟合曲线见图2。

图2 果醋菌生长量实验值与预测值模型拟合曲线Fig.2 Fitting curve of experimental values and predicted values of fruit vinegar bacteria growth amount

由图2可知，果醋菌生长量在发酵期间的变化情况与Logistic模型拟合曲线很吻合，模型决定系数为0.9923，说明果醋菌在发酵过程中的生长变化情况能够用Logistic模型进行很好的反映。

2.2 产物醋酸生成动力学模型。

产物生成动力学模型目前用的比较多的是由Luedeking和Piret描述乳酸发酵时所提出的数学模型(Luedeking-Piret模型)，其形式为：

(4)

根据产物形成与菌体生长的关系，当a≠0，b=0时，产物形成与菌体生长相关联。

对式(4)积分，得：

P(t)=a[y(t)-A1]。

(5)

式中：P(t)为醋酸生成量，g/dL，a为生长偶联参数，A1为初始醋酸菌生长量(OD值)。将式(3)带入式(5)，利用Origin 8.6软件进行非线性拟合，得a=17.1589，醋酸生成量随发酵时间的动力学模型方程为：

(6)

醋酸生成量实验值与预测值拟合曲线见图3，实验值与预测值具有较高的一致性，实验值与拟合曲线进行了很好的拟合，Luedeking-Piret模型的决定系数R2=0.9933，表明该模型能够很好地反映出在复合果醋发酵过程中醋酸的实际生成情况。

图3 醋酸生成实验值与预测值模型拟合曲线Fig.3 Fitting curve of experimental values and predicted values of acetic acid production

2.3 底物酒精消耗动力学模型

在复合果醋的发酵过程中，酒精的消耗模型包括底物消耗以维持细胞呼吸新陈代谢作用、供给菌体生长、形成产物三个部分。通过物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程：

(7)

式中：Y为酒精浓度，%；A1为初始酒精浓度，%；A2为酒精终浓度，%；x为自变量;x0、dx为方程系数。

通过Origin 8.6软件对酒精浓度和方程式(7)进行拟合，得A1=13.674，A2=0.8202，x0=5.1272，dx=1.4877。带入式(7)得酒精浓度随发酵过程变化的动力学模型为：

(8)

酒精消耗实验值与预测值模型拟合曲线见图4。随着发酵时间的变化，酒精浓度的变化数据与动力学模型拟合曲线的变化趋势非常符合，此动力学模型的R2=0.9951，说明酒精浓度的实验值与预测值能够很好地拟合，该模型能很好地反映发酵过程中底物酒精的消耗情况。

图4 酒精浓度与预测值模型拟合曲线Fig.4 Fitting curve of experimental values and predicted values of alcohol content

3 结论

本实验以桑葚、草莓为原料，混合榨汁后加入酵母进行发酵，得到酒液透亮清澈，色泽呈深红色，带有菠萝清香的复合果酒，然后加入果醋菌进行醋酸发酵，最终获得色泽深红、具有果香和醋香的复合果醋。在桑葚-草莓复合果醋的发酵过程中对果醋菌生长量、醋酸生成量、酒精浓度进行了测定，在整个发酵阶段，果醋菌生长量、醋酸生成量及酒精浓度的变化趋势相互关联，发酵的第3～8天，果酸菌生长量大幅度上升，进入生长对数期，此时，醋酸的生成量也以类似的变化趋势进行增长，而酒精浓度在这一时期大幅度下降。发酵结束后(第10天)复合果醋中酒精浓度为1.4%，醋酸含量为6.89 g/dL；利用Origin 8.6软件对数据进行非线性拟合，以Logistic方程建立了桑葚-草莓复合果醋的菌体生长量动力学模型，以Luedeking-Piret模型建立了醋酸生成的动力学方程，以Boltzmann模型建立了酒精浓度的动力学模型，其决定系数R2分别为0.9923，0.9932，0.9951。实验值与3种动力学模型的拟合曲线拟合程度很高，说明3种动力学模型对桑葚-草莓复合果醋在发酵过程中菌体生长量、醋酸生成量及底物酒精浓度消耗的实际变化情况能进行很好的描述。

通过桑葚-草莓复合果醋发酵动力学模型的建立，将进一步掌握果醋菌、醋酸生成及酒精消耗在果醋发酵过程中的生理生化及动力学特征，也能反映出这三者之间的相互关系，将为今后桑葚-草莓复合果醋的工业化生产提供一定的理论依据。