鲁氏酵母不同时间的添加对高盐稀态酱油的影响
2020-09-16韩冉张珊余倩倩侯丽华
韩冉，张珊，余倩倩，侯丽华
(天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457)
酱油是东亚国家的重要调味品之一，距今已有上千年的历史，伴随着人们对酱油风味的高要求，市场中酱油品种也日趋多样化，高盐稀态发酵酱油因其独特的风味具有较大的市场前景。高盐稀态发酵酱油与一般酱油制法不同之处在于成曲后加入原料总重2～2.5倍的18%～20%盐水，并且通过添加耐盐酵母菌增加酱油的风味和提高酱油的品质[1]，发酵时间较长，一般为4～6个月。
鲁氏酵母(Saccharomycesrouxii，简称S酵母)，是一种耐高渗透压酵母菌，其在含盐量18%的生长条件下仍具有活力。将该种酵母应用于高盐稀态发酵酱油中可将糖类物质继续分解，从而生成醇类、酯类、酮类、酸类等香气成分，赋予酱油醇香浓郁的新风味。已有研究表明，微生物的添加方式与酱油的风味息息相关[2]。目前对于不同时间添加鲁氏酵母于高盐稀态酱油发酵中的研究相对较少。本文通过测定相关理化指标和对比风味物质研究鲁氏酵母对高盐稀态发酵酱油的影响，为酱油企业添加耐盐酵母提供了理论支撑。
1 材料与方法
1.1 原料及菌株
原料：豆粕、炒小麦。
菌种：米曲霉沪酿3.042、酵母S1(鲁氏酵母菌CBS732)和酵母S2(鲁氏酵母菌JBCC-49)，为本实验室保藏菌种。
1.2 实验方法
1.2.1 制曲工艺
1.2.1.1 种曲制备
按麸皮∶水为1∶1.1的比例拌水，灭菌处理后接种3～4环孢子，32 ℃恒温堆积培养。15 h后振荡打散曲料，然后调温至30 ℃平铺培养，7 h后第二次振荡打散，3 d后将成熟种曲烘干备用。
1.2.1.2 大曲制备
原料(豆粕与炒小麦比为6∶4)500 g，其中豆粕经1.1倍温开水浸泡30 min至充分吸水，随后原料经曲布包扎后进行高压灭菌处理。灭菌后将曲料及时打散，曲料温度降到40 ℃时拌入种曲(原料质量的0.4%)并充分混匀，30 ℃堆积培养。12～16 h后，第一次翻曲，继续培养6～8 h，第二次翻曲。28 ℃进一步培养，培养40 h至大曲原料呈均匀的黄绿色，即为成曲。
1.2.2 发酵工艺
将成曲收入发酵容器中，加入20%的盐水(原料干重2.5倍)搅拌均匀，封口进行发酵，初始发酵温度15 ℃，每天升高1 ℃，30 ℃封顶，共发酵150 d，发酵过程中定期搅拌。在发酵第15，30，45天分别添加S1、S2酵母菌，添加量均为2×105CFU/g。
1.2.3 酱油发酵过程中指标的测定
发酵过程中每15 d进行一次取样，直至第150 天。取样酱醪在8000 r/min条件下离心6 min后得上清，对其各指标进行跟踪测定。
1.2.3.1 总酸的测定
总酸含量按照国标GB/T 5009.39-2003[3]规定的方法测定。
1.2.3.2 氨基酸态氮的测定
氨基酸态氮含量按照国标GB/T 5009.39-2003规定的方法测定。
1.2.4 发酵结束后指标的测定
1.2.4.1 液相色谱测定分析有机酸
色谱柱：Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm I.D.)流动相：0.03 mol/L KH2PO4(磷酸调pH为3.0)；紫外检测器波长：215 nm；流速：0.5 mL/min；进样量：20 μL。
1.2.4.2 固相微萃取-气质联用(SPME-GC-MS)测定分析风味物质
GC-MS条件：GC条件：采取程序升温，起始温度40 ℃，保持10 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，最后以6 ℃/min升至220 ℃；进样口温度250 ℃，载气为氦气，流速为1 mL/min，不分流进样；MS条件：接口温度为220 ℃，离子源温度为230 ℃，电离方式为EI，电子能量为70 eV，质量扫描范围为33～450 amu[4,5]。
2 结果与分析
2.1 酱油发酵过程中总酸的测定
在高盐稀态发酵过程中，酱油中酸类物质增加，主要来自产酸菌产生乳酸、乙酸等酸类物质[6]，还包括柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸等有机酸。适量酸味可以中和酱油中的咸味，使酱油滋味变得柔和，但是总酸含量太高时也会使酱油的味道和气味变差[7]。
(a)
(b)
由图1中(a)可知，S1酵母最终发酵的总酸含量15 d+S1<45 d+S1<30 d+S1<空白，数值分别为1.18，1.19，1.28，1.42 g/dL；由图1中(b)可知，S2酵母最终发酵的总酸含量30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2<空白，数值分别为1.28，1.34，1.41，1.42 g/dL。发酵后期，添加酵母发酵组的酸类物质被利用生成酯类、醛类等其他风味物质，因此其总酸含量均低于空白组的总酸含量。
2.2 酱油发酵过程中氨基酸态氮含量的测定
酱油原料中蛋白含量丰富，发酵过程中经酶水解成小分子的肽和氨基酸，也就是酱油中主要的呈鲜物质[8]，决定酱油的分级。
(a)
(b)
由图2可知，发酵初期，氨基酸态氮含量快速增加，蛋白酶系活力旺盛，此外在高浓度盐水的渗透压作用下，原料中的可溶性氮和钠离子发生快速交换，导致发酵液中氨基酸态氮持续增加。发酵后期，酱醪中微生物代谢消耗掉一部分氨基酸态氮，最终生成与消耗速率平衡，含量逐渐趋于稳定。由图2中(a)可知，S1酵母最终氨基酸态氮含量空白<45 d+S1<15 d+S1<30 d+S1，数值分别为0.91，0.92，0.98，1.00 g/dL，S1在第30 天添加时较优；由图2中(b)可知，S2酵母最终氨基酸态氮含量为空白<30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2，数值分别为0.91，0.94，0.95，0.97 g/dL，S2在第45天添加时较优。各组在发酵结束时氨基酸态氮含量均>0.80 g/dL，符合国标GB/T 18186-2000中特级酱油的相关规定。
2.3 有机酸含量检测
有机酸赋予酱油香气，并且中和高盐分带来的咸味，对酱油的口感起调节作用[9]。酱油中的有机酸以乳酸为主。本实验通过高效液相色谱法进行检测与分析，各个发酵组的有机酸含量见表1，各发酵组的有机酸种类基本一致。琥珀酸入口呈爽口酸味；乙酸等在烹饪过程中可与醇类等反应，生成具有特殊风味的酯类；草酸含量过量会危害人体健康，各组草酸含量均在国标范围内。30 d+S1组乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S1组和45 d+S1组；45 d+S2酵母组中乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S2组和30 d+S2组。
表1 添加单种酵母发酵组中有机酸含量Table 1 The content of organic acids in the fermentation group adding single yeast
2.4 风味物质检测
表2 添加单种酵母发酵组风味物质种类的比较Table 2 The types of flavor substances in the fermentation group adding single yeast
在所有的风味物质中，酯类物质作为酱油的主要香气成分所占比重最大，见表2。对比各发酵组，30 d+S1发酵组中酯类物质种类最多，为25种。其次占比大的是醇类物质，经检测，乙醇、异戊醇和苯乙醇含量较高，总体占醇类物质的90%以上，乙醇主要来自以酵母利用糖类进行的酒精发酵过程[10,11]，异戊醇和苯乙醇均由氨基酸经Ehrlich反应生成，苯乙醇是具有蔷薇花香气的化合物[12]。此外，重要风味组成成分3-甲硫基丙醇和1-辛烯-3-醇也在添加耐盐酵母S1的发酵组中被检测到[13,14]。由表2可知，30 d+S1发酵组中检测到的醇类物质种类较多，为20种。醛类物质的简单化合物具有强烈的刺激性香气，而且醛类与醇类等反应均可产生不同于本身的香气，例如，异戊醛与硫化氢共存时可以形成强烈的焦香气味。本实验中检测到的主要醛类物质有异丁醛、异戊醛、苯甲醛和苯乙醛。在各发酵组中，45 d+S2发酵组中检测出的醛类和酮类物质种类高于其他组。酱油的酸类物质也关系到产品的香气，45 d+S2酵母组的酸类物质种类最高。此外，30 d+S1组与45 d+S2组的总风味物质种类较高，分别为71种和72种。
2.5 不同时间添加两种酵母有机酸含量及风味物质种类
由上述结果可知，添加单种酵母时，30 d添加S1酵母较佳，45 d添加S2酵母较佳。为了达到更好的发酵效果，采用S1、S2酵母不同时间混合添加的方法进行验证，即30 d+S1+45 d+S2组。发酵最终总酸含量为1.42 g/dL，总氨基酸态氮含量为1.01 g/dL。
表3 不同时间添加多种酵母发酵组有机酸含量及风味物质种类的比较Table 3 Comparison of content of organic acids and types of flavor substances in the fermentation group adding various yeasts at different time
由表3可知，30 d+S1+45 d+S2组中重要酸类物质苹果酸、乳酸、乙酸、富马酸以及琥珀酸的含量均高于30 d+S1组和45 d+S2组；在风味物质种类的检测中，30 d+S1+45 d+S2组也呈现出明显优势，最终种类达到78种。经验证，最佳发酵方法为第30 天添加S1酵母后在第45 天添加S2酵母。
3 结论
在单一酵母发酵实验中得知同一种酵母不同株添加时间的不同对发酵效果影响不同，因此需要分别进行条件优化，从而得到最佳发酵方式。根据单一酵母实验推断得到最优的混合发酵方式，并进行了相关验证，结果与预期一致，表明在不同时段添加不同种类的耐盐酵母发酵结果更优，为企业实际生产高盐稀态发酵酱油提供了更多的理论依据。今后的研究中将进行不同酵母之间的相互作用分析以及不同株酵母添加不同量时对发酵效果的影响。
