石榴皮原花青素对变异链球菌生物膜形成及相关毒力基因表达的影响

高 洁,赵玮钦,程 政

(1陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室,西安 710004;2西安交通大学口腔医院综合科;3西安科技大学化工学院;4国土资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室;*通讯作者,E-mail:gaojie-12@163.com)

龋病是危害人类口腔健康最普遍的疾病,其发病率高,分布广,是世界上最流行的疾病之一[1]。变异链球菌(Streptococcusmutans)是人类口腔主要的致龋菌,它可以利用蔗糖形成细胞外多糖,黏附并定植于牙齿表面,促进牙菌斑生物膜的形成[2]。以生物膜形式存在的变异链球菌才有可能在复杂多变的口腔环境中赖以生存。牙菌斑生物膜形成后进一步促进致龋菌对牙釉质黏附,增强致龋菌的产酸能力,并能抵抗药物的渗透能力,加速了龋病的发生。密度感应(quorum sensing, QS)是变异链球菌调控网络中的重要部分[3],调节变异链球菌的基因感受刺激多肽、生物膜的形成及耐酸反应,影响生物膜中细菌的适应和毒力因子的产生[4],其中ComCDE系统[3]与生物膜中gtfB、gtfC、gbpB等相关基因的表达有关;LuxS系统可以催化信号肽AI-2形成,抑制变异链球菌的生长以及耐酸能力[5]。因此,干扰变异链球菌毒力基因的表达对密度感应系统及生物膜的形成具有重要作用。

龋病的有效防治一直是国内外关注的热点,公认的氟化物防龋、抗菌药物的应用以及免疫防龋等方法均有一定的局限性。近年来,天然药物因产地丰富、抗菌活性强、毒性低等优势在龋病防治中受到了关注[6]。研究表明,原花青素对变异链球菌生物膜的蛋白具有抑制作用[7]。本研究探讨石榴皮原花青素对变异链球菌生物膜的形成及相关毒力基因表达的影响,以期达到防治龋病的目的。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

变异链球菌UA159:空军军医大学口腔医院提供;脑心浸液培养基(BHI):青岛海博生物科技有限公司;氯已定(Chlorhexidine, CHX)、甲基四氮盐(XTT):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;引物:上海博尚生物技术有限公司;Total RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR预混液、反转录试剂盒:赛默飞世尔科技(中国)有限公司。实时荧光定量PCR仪:赛默飞世尔科技(中国)有限公司;多功能酶标仪:山东博科科学仪器有限公司;微孔板培养箱(SI19):上海昕瑞仪器仪表有限公司;紫外分光光度计UV-5800H(PC):上海元析仪器有限公司;生物安全柜(BHC-1000IIA2)、厌氧培养箱(YQX-II)：上海跃进医疗器械有限公司；气相色谱-质谱联用：安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 变异链球菌液制备

变异链球菌UA159在厌氧培养箱中37 ℃静置厌氧培养(10% CO2、10% H2、80% N2),革兰氏染色镜检菌落生长形态,确认无污染后,将单个菌落接种到BHI培养基中,37 ℃厌氧培养24 h,利用紫外分光光度计将菌液浓度调至OD600=0.1备用。

1.3 石榴皮原花青素溶液配制

石榴皮原花青素为西安科技大学化工学院提供,用无菌水配制成320 mg/ml的母液置于4 ℃保存;工作液用BHI液体培养基将石榴皮原花青素母液稀释成160 mg/ml;氯已定(chlorhexidine,CHX)用BHI液体培养基稀释成40 mg/ml。

1.4 生物膜形成最低抑制浓度测定

本实验分为4组:石榴皮原花青素组、氯已定组、空白对照组和阴性对照组。空白对照组采用BHI液体培养基;阴性对照组采用含变异链球菌UA159菌液的BHI液体培养基。

实验浓度每组4个重复。在96孔细胞培养板中1-7号孔均加入100 ml的BHI培养液,2-6号A-D孔加入100 μl浓度为160 mg/ml的石榴皮原青花素工作液,依次进行倍比稀释后,每孔石榴皮原花青素浓度分别为40,20,10,5,2.5 mg/ml;2-6号E-H孔加入100 μl浓度为40 mg/ml的CHX工作液,依次进行倍比稀释后,氯已定浓度分别为10,5,2.5,1.25,0.625 mg/ml。1号孔空白对照组再次加入100 ml的BHI培养液,2-7号各孔依次加入变异链球菌UA159菌液100 μl 1×106CFU/ml,7号孔为阴性对照组。96孔板置于CO2厌氧培养箱37 ℃孵育48 h,去除培养液后用无菌PBS缓冲液洗板3次,每孔加入XTT溶液100 μl,避光培养2 h后酶标仪A490 nm读数。MIC为抑制变异链球菌生物膜形成最低药物浓度,分别计算石榴皮原花青素组与氯已定组影响变异链球菌生物膜的抑制率:

1.5 琼脂糖孔穴扩散法测定抑菌活性

100 ml BMI琼脂糖培养基灭菌后冷至50 ℃,加入5 ml对数生长期的变异链球菌UA159悬液(菌体数107个/ml),混匀后倒入培养皿(直径9 cm),每皿20 ml,放置40 min,使培养基固化。用无菌打孔器在培养基上均匀打孔(直径6 mm),向孔中加入100 μl样品,DMF作空白对照。石榴皮原花青素浓度为10 mg/ml;氯已定浓度为2.5 mg/ml。37 ℃培养18 h,测量抑菌圈直径(单位:mm)。

1.6 变异链球菌总RNA的提取

浓度为5 mg/ml和10 mg/ml石榴皮原花青素组、2.5 mg/ml氯已定组、空白组,分别在6孔细胞培养板中将变异链球菌UA159培养48 h后,去除培养液,用无菌PBS缓冲液冲洗3次,用细胞铲将生物膜态变异链球菌收集到2 ml离心管中,各离心管中分别加入35 mg/ml的溶解酶500 μl,混匀后于37 ℃孵育4 h之后操作均在室温中进行。依照试剂盒说明书RNAisoTM Plus(Total RNA提取试剂)提取细菌总RNA。

1.7 逆转录变异链球菌毒力基因RNA

依照反转录试剂盒说明书的步骤将RNA反转为cDNA,置于-20 ℃中保存备用。

1.8 real-time PCR检测变异链球菌UA159毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf的表达

利用NCBI Primer-BLAST设计最优引物(见表1)。PCR反应体系为25 μl:2×Taq PCR Mastermix 12.5 μl,上下游引物各0.5 μl,DNA模板1 μl,ddH2O补足25 μl反应体积。PCR反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,61 ℃退火30 s,30个循环。real-time PCR扩增完成后分析熔解曲线。如果Ct值≤35则判定为阳性,Ct值>35或无Ct值判定为阴性。每个样品均设毒力基因检测管与内参基因检测管,采用2-ΔΔCt对样本进行相对定量。

表1 引物序列

1.9 统计学分析

SPSS 22.0软件进行统计学分析,两组数据间比较采用Studentt检验,多组数据间比较采用One-way ANOVA检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 石榴皮原花青素和CHX对变异链球菌生物膜形成的影响

随着石榴皮原花青素和CHX药物浓度的增加,吸光度值A值减小(见图1)。10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX的吸光度A值都显著减小,其抑制率显著增强(见图1)。石榴皮原花青素对变异链球菌的MIC为10 mg/ml,抑制率为91.9%;CHX对变异链球菌的MIC为2.5 mg/ml,抑制率为90.9%(见表2)。

图1 石榴皮原花青素和氯己定对变异链球菌生物膜形成的吸光值Figure 1 Effect of pomegranate peel procyanidins and CHX on absorbance of Streptococcus mutans biofilm

表2 石榴皮原花青素和CHX对变异链球菌生物膜形成的抑制率

2.2 琼脂糖孔穴扩散法测定抑菌活性

琼脂糖孔穴扩散法结果显示,加入100 μl 10 mg/ml石榴皮原花青素,37 ℃培养18 h后,形成的抑菌环外径为28 mm;加入100 μl 2.5 mg/ml CHX,37 ℃培养18 h后,形成的抑菌环外径为24 mm(见图2)。石榴皮原花青素和CHX均可以形成明显的抑菌环,可见石榴皮原花青素和CHX均可以有效抑制变异链球菌UA159的生长。

2.3 石榴皮原花青素对变异链球菌毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf表达水平的影响

根据石榴皮原花青素和CHX对变异链球菌UA159的MIC结果,选取5 mg/ml石榴皮原花青素、10 mg/ml石榴皮原花青素及2.5 mg/ml CHX分别作用变异链球菌UA159,检测变异链球菌UA159毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf的mRNA表达水平,10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX分别作用于变异链球菌UA159后,各毒力基因mRNA的表达水平与空白对照组相比均显著下调(P<0.01)。10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX对变异链球菌UA159毒力基因的mRNA表达水平无显著差异(见图3)。

A.空白对照B.10 mg/ml石榴皮原花青素 C.2.5 mg/ml CHX图2 琼脂糖孔穴扩散法测定石榴皮原花青素和CHX对变异链球菌的抑菌活性Figure 2 Both pomegranate peel procyanidins and chlorhexidine effectively inhibit Streptococcus mutans by agarose hole diffusion method

3 讨论

原花青素(proantho cyanidins,PC)是以黄烷-3-醇为结构单元通过C-C键聚合而形成的化合物,又名缩合鞣质,是自然界中广泛存在的一类聚多酚类混合物。人们对众多不同植物中提取出的PC进行了大量研究,发现PC具有抗氧化清除自由基活性;抑制肿瘤细胞的生长;诱导肿瘤细胞凋亡;调节免疫等多种药理作用[8,9]。原花青素由于来源广泛、毒副作用小,近年来也用于了口腔方面的研究。最常见是从葡萄籽中提取的原花青素,它具有抑制变异链球菌生长和产酸、减少大鼠龋病发生的作用[10],可以通过促进一氧化氮合酶合成一氧化氮抑制变异链球菌生长[11]。同时也有学者发现高粱原花青素(SPC)四聚体对引起龋病的主要致病菌变异链球菌的黏附有抑制作用[12,13]。

石榴皮为石榴科石榴干燥的果皮,其中含有大量原花青素。石榴皮中含有的多酚类物质,主要包括鞣质化合物和黄酮化合物,新鲜石榴皮中黄酮含量为6%左右,原花青素为其主要的黄酮化合物成分。石榴皮原花青素对多种细菌和真菌都具有抑制作用,柯春林等[14]报道石榴皮原花青素提取液对单增李斯特菌有明显的抑菌活性。如今,石榴皮原花青素的抑菌机制尚无明确定论,推测可能是抑制菌体细胞蛋白的合成及对数生长期的菌体分裂,使菌体表面及内部结构均发生改变,从而导致细胞壁被破坏,引起细胞核固缩,最终使菌体的生长繁殖受到抑制而死亡[15]。

变异链球菌是牙菌斑的主要致病菌,抑制变异链球菌的生长和生物膜形成对防龋具有的重要的作用。氯己定虽然可以有效抑制变异链球菌,但是用于防龋的同时常对口腔正常菌群造成破坏,长期使用还会引起口腔着色和味觉改变,这些副作用限制了氯己定在口腔局部的长期应用。我国石榴产量高,石榴皮作为一种天然抑菌植物资源,对于解决致病菌的耐药性逐渐增强的问题具有一定优势。因此,本实验中采用氯己定作为阳性对照,探讨石榴皮原花青素对变异链球菌生物膜的抑制。研究发现石榴皮花原青素可以有效抑制变异链球菌生物膜,推测其可能是通过抑制变异链球菌相关毒力基因的表达而影响其生物膜形成。因此,石榴皮原花青素作为一种新型开发的天然防龋药物具有良好的应用前景。