上皮性卵巢恶性肿瘤中SFRP1的表达及与β-catenin的相关性

顾中亮,尉春艳

(西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:weichy1023@163.com)

上皮性卵巢恶性肿瘤在女性生殖系统肿瘤里发病率虽居第3位,其死亡率却居于首位,且5年生存率小于50%,严重威胁女性健康[1,2]。研究表明,分泌型卷曲蛋白1(secretory crimp protein,SFRP1)作为分泌型卷曲相关蛋白家族(secreted frizzled-related proteins family,SFRPs)的一员,由定位于后者8q12-11.1位点的基因编码[3]。SFRP1作为Wnt的一种特异性拮抗剂可直接作用于Wnt蛋白,从而发挥负调控Wnt/β-catenin信号通路的作用[4,5]。Wnt/β-catenin信号通路对大部分动物的细胞生长、分化、成熟起着关键的调控作用,近年来较多研究发现其异常激活与大部分肿瘤如宫颈癌、直肠癌、乳腺癌、胰腺癌等均存在显著相关性[6]。由于目前SFRP1也被定义为一种新的抑癌基因,其异常表达可能干扰Wnt信号通路进而参与某些肿瘤的发生或转移[5],但是,其在上皮性卵巢恶性肿瘤的病理发展过程中是否也是通过Wnt/β-catenin信号通路进而参与其中尚未清楚,因此本研究试图探究其作用机制并报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集2017年9月至2018年12月于西安交通大学第二附属医院就诊的85例上皮性卵巢恶性肿瘤患者作为研究对象,年龄为25-58岁。所有患者均接受手术治疗并经病理确诊(浆液性癌38例,黏液性癌24例,透明细胞癌7例,子宫内膜样癌16例),且均未接受放疗、化疗及其他抗肿瘤治疗;所有患者均未合并其他原发性肿瘤。患者按(FIGO,2000)标准[7]进行手术-病理分期,其中Ⅰ期34例,Ⅱ期32例,Ⅲ期10例,Ⅳ期9例;按病理学进行分组,其中G1高分化组37例,G2中分化组30例,G3低分化组18例;按是否伴有淋巴结转移进行分组,其中淋巴转移组28例,非淋巴转移组57例。本研究已通过我院伦理委员会审批。

1.2 材料与方法

1.2.1 免疫组化检测SFRP1表达情况 按照说明书,采用免疫组化(SP)法观察SFRP1阳性反应情况。试剂由北京雷根生物技术有限公司提供。由病理科医师,光学显微镜下连续选取5个视野,每个视野计数100个细胞,记录细胞膜与细胞质棕黄色染色的SFRP1阳性细胞总数,随后计算平均阳性细胞百分含量(5个视野阳性细胞总数÷5×100%)。平均阳性细胞百分含量≤2%为阴性,>2%为阳性[3]。比较不同手术-病理分期、病理学分组、淋巴结转移情况时SFRP1表达阳性率(计算公式为SFRP1表达阳性例数÷总例数×100%)。

1.2.2 Western blot检测β-连环蛋白(β-catenin)表达情况 组织经破碎后,蛋白裂解液提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,遵循说明书步骤执行等体积稀释,4 ℃冰浴下SDS-PAGE电泳,转移、洗脱、封板、孵育、洗涤,ECL化学发光,显影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为参照进行读数。兔β-catenin一抗及二抗由北京雷根生物技术有限公司提供。采用ImageJ检测蛋白表达量并计算相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 上皮性卵巢恶性肿瘤组织SFRP1免疫组化染色

免疫组化染色后,镜下可见SFRP1阳性细胞的细胞膜与细胞质呈棕黄色染色,但较正常卵巢组织染色程度轻(见图1)。

2.2 上皮性卵巢恶性肿瘤SFRP1的表达阳性率比较

手术-病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者的SFRP1表达阳性率不同,差异有统计学意义(P<0.05);其中Ⅰ期的SFRP1表达阳性率显著高于Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同病理学分级患者的SFRP1表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。有淋巴结转移组患者的SFRP1表达阳性率显著低于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 不同临床特征上皮性卵巢恶性肿瘤患者的SFRP1表达

2.3 上皮性卵巢恶性肿瘤β-catenin蛋白表达的比较

不同手术-病理分期上皮性卵巢恶性肿瘤的β-catenin蛋白相对表达量不同(P<0.05),从Ⅰ-Ⅳ期β-catenin相对表达量逐渐增高,差异有统计学意义(P<0.05)。不同病理学分组上皮性卵巢恶性肿瘤的β-catenin相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。上皮性卵巢恶性肿瘤伴有淋巴结转移时,β-catenin相对表达量高于无淋巴结转移患者,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

A.上皮性卵巢恶性肿瘤组织 B.正常卵巢组织阳性对照图1 上皮性卵巢恶性肿瘤组织SFRP1免疫组化染色情况 (×400)Figure 1 Immunohistochemical staining of SFRP1 in epithelial ovarian malignant tumor (×400)

表2 上皮性卵巢恶性肿瘤β-catenin表达情况

2.4 上皮性卵巢恶性肿瘤SFRP1平均阳性细胞百分含量与β-catenin的相关性

由Pearson分析可见,上皮性卵巢恶性肿瘤SFRP1平均阳性细胞百分含量与β-catenin表达量呈负相关性(r=-0.757,P<0.001,见图2)。

图2 上皮性卵巢恶性肿瘤SFRP1平均阳性细胞百分含量与β-catenin的相关性Figure 2 Correlation between the percentage of SFRP1 positive cells and β-catenin in epithelial ovarian malignant tumors

3 讨论

由于SFRPs在肿瘤染色体中频繁出现某等位基因的表达缺失[8],因此被广泛关注,而SFRP1作为其中一员,在抑制肿瘤的发生中也具有重要作用[9]。既往有研究发现,SFRP1参与了卵巢癌的发生、发展,且在高淋巴转移能力的卵巢癌中表达减少[10],但其在上皮性卵巢恶性肿瘤发生、发展中的作用及机制尚未完全明确。通过对上皮性卵巢恶性肿瘤确诊患者肿瘤组织的研究,我们发现,上皮性卵巢恶性肿瘤在手术-病理分期Ⅲ期、Ⅳ期及有淋巴结转移时,SFRP1表达阳性率明显降低,这与张孝艳等[11]及曹丽雯等[5]在宫颈癌中的研究结果相近。其中张孝艳等[11]在对比正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织的SFRP1表达阳性情况后,即发现三者的表达阳性率依次降低,且伴随宫颈癌手术-病理分期升高逐渐下降并以Ⅳ期最低;但不同之处在于有淋巴结转移者的SFRP1表达阳性率高于无转移者。在针对其他系统肿瘤的研究中,也发现与本研究类似的SFRP1阳性表达情况,如王建等[12]在对非小细胞肺癌组织的检测中即发现,癌症手术-病理分期越高,SFRP1表达阳性率越低,伴有淋巴结转移时的表达阳性率也低于未转移者;Buim等[13]也发现,在侵袭性膀胱癌中,肿瘤手术-病理分期越高,SFRP1表达阳性率越低。然而,也有研究发现,在某些肿瘤中,SFRP1表达情况与上述不同。如Sanini等[14]发现,在转移性肾细胞癌中,SFRP1存在过度表达现象;Hoei-Hansen等[15]发现,在睾丸原位癌中,SFRP1较正常睾丸组织也呈现过度表达;另外,Joesting等[16]也发现,前列腺肿瘤较正常成人前列腺,其SFRP1表达也显著增高;而Lin等[17]发现,在慢性应激所致肝细胞癌中,SFRP1表达也呈增高趋势。分析在不同疾病中SFRP1表达情况不同的原因,可能是因为在不同器官组织里SFRP1参与肿瘤发展所关联的信号通路不同所致,也可能因为在不同组织中SFRP1基因表达下调分别为缺失或甲基化等不同原因所致[8,18,19]。

有研究表明,多种肿瘤及其临床分型、分化程度及侵袭性均与SFRP1异常降低相关[20-22],而该作用主要通过SFRP1对Wnt信号通路调控实现[23-25]。Wnt蛋白是一种分泌性糖蛋白家族,参与细胞分化、生长的调控,而Wnt/β-catenin是其主要信号通路。Wnt/β-catenin信号通路调控异常已被证实在多种肿瘤如肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、胃癌等中有重要作用[6,26-30],且有研究表明该信号通路在卵巢癌的发生发展中有重要作用[31-34],而SFRPs作为Wnt的特异性拮抗剂之一,是否通过Wnt/β-catenin通路在上皮性卵巢恶性肿瘤的发展过程中发挥作用,尚不清楚。我们通过对不同手术-病理分期、不同病理学分级和淋巴转移情况上皮性卵巢恶性肿瘤中β-catenin的检测,发现:从手术-病理分期Ⅰ期至Ⅳ期β-catenin相对表达量逐渐增高,而上皮性卵巢恶性肿瘤伴有淋巴结转移时的β-catenin相对表达量高于无淋巴结转移患者,上述情况均与SFRP1阳性表达情况趋势相反;而不同病理学分级上皮性卵巢恶性肿瘤的β-catenin相对表达量无统计学差异,此特征也与SFRP1阳性表达情况相似。通过进一步分析SFRP1平均阳性细胞百分含量与β-catenin表达的关系,可见两者呈强负相关,提示SFRP1可能通过Wnt/β-catenin信号通路进而于上皮性卵巢恶性肿瘤的发生发展及侵袭过程中发挥作用。分析其机制,上皮性卵巢恶性肿瘤时,Wnt/β-catenin信号通路激活且调节异常[31,34],SFRP1高表达时可抑制该通路,改善肿瘤的临床分级及侵袭性;但是,SFRP1并非仅发挥拮抗剂的作用,还具有双向性,即高表达时可拮抗Wnt/β-catenin信号通路,但低表达时可激活Wnt/β-catenin通路进而导致肿瘤临床分级增加、侵袭性增加[23,35,36]。然而,不同病理学分级上皮性卵巢恶性肿瘤的SFRP1阳性表达情况及β-catenin表达无统计学差异,其原因仍有待进一步实验分析。

综上所述,上皮性卵巢恶性肿瘤中SFRP1与β-catenin表达存在着显著负相关性,SFRP1可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与上皮性卵巢恶性肿瘤的发生、发展,值得关注。