ARMS法在肺腺癌EGFR基因突变检测中的应用及意义

朱启淦,陈丽丹,禹 乐,刘金发,任红岳,耿月华,魁国菊,孟加榕*

(1中国人民解放军联勤保障部队第九○九医院,厦门大学附属东南医院病理科,漳州 363000;2中国人民解放军联勤保障部队第九○九医院,厦门大学附属东南医院老年病房;*通讯作者,E-mail:mengjiarong@sina.com)

肺癌是常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率居各类恶性肿瘤之首,严重危害人群健康[1]。手术仍是早期患者的最佳治疗手段,晚期肺癌的主要治疗方案一直是细胞毒化疗,但晚期肺癌患者的生存率及预后并不理想[2]。EGFR是一种受体型酪氨酸激酶,通过信号转导控制肿瘤生长,与新生血管生成、肿瘤的侵袭和转移等有密切关系,近10年来,针对表皮生长因子受体的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)在临床取得显著疗效,引领肺癌靶向治疗的前行步伐[3,4]。靶向治疗首先要明确EGFR基因状态,以便合理用药。本实验采用ARMS法对厦门大学附属东南医院病理科确诊的232例肺腺癌不同标本类型检测EGFR基因突变,分析与患者性别、年龄以及病理类型之间的关系,进而为肺腺癌患者个体化靶向治疗提供分子病理学依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集厦门大学附属东南医院2019年1-12月肺腺癌标本行EGFR检测232例。其中男性141例,女性91例;年龄27-89岁,中位年龄64岁。手术切除标本16例,肺活检标本126例(包括肺穿刺和支气管镜活检),恶性胸腔积液细胞块标本35例,转移病灶标本55例(包括淋巴结、骨、肝等转移)。

1.2 试剂与仪器

GS-脱蜡液购于哈尔滨格林标本技术开发有限公司,石蜡包埋组织切片核酸(paraffin embedded tissue sections DNA,FFPE DNA)提取试剂盒、人类EGFR基因突变检测试剂盒均购于厦门艾德生物医药科技股份有限公司,Amoydx-Giraffe紫外分光光度计SMA4000,美国ABI7500 Real Time PCR System实时荧光定量PCR仪。

1.3 FFPE DNA的提取

按5-10 μm的厚度对石蜡包埋组织进行切片,取5-10片置于1.5 ml离心管中(组织面积<0.5 cm2者适当增加切片数量),加入GS-脱蜡液1 ml[5],振荡混匀10 s,室温13 000g离心2 min,小心去除上清(勿吸到沉淀);加入1 ml无水乙醇,振荡混匀10 s,室温13 000g离心2 min,小心去除上清,室温开盖放置15 min或37 ℃下开盖放置5-10 min,使乙醇充分挥发,按FFPE DNA提取试剂盒操作方法及步骤进行样本基因组DNA提取。DNA需立即检测,或-20 ℃保存。

1.4 FFPE DNA浓度测定

应用紫外分光光度计检测DNA样品浓度与质量,所提DNA浓度的OD260/280应在1.8-2.0之间,OD260/230应大于2。DNA稀释浓度为2-3 ng/μl。

1.5 ARMS PCR检测EGFR基因突变

分别向42.3 μl已稀释为2 ng/μl待检样品DNA、EGFR阳性质控品、纯化水中加入2.7 μl Taq酶,将混好的DNA样品依次取5 μl加入8联PCR反应条中,离心,放入ABI7500实时PCR仪中。反应程序:95 ℃ 5 min,1个循环;95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15个循环;93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s(采集荧光),72 ℃ 20 s,31个循环。

1.6 结果判断

EGFR基因突变29位点包括EGFR基因的18、19、20及21外显子,突变包含Exon-18(G719A、G719S、G719C)、Exon-19(19-Del)、Exon-20(20-Ins、T790M、S768I)、Exon-21(L861Q、L858R)等。突变结果判断严格按照试剂盒说明书提供检验结果解释进行。

1.7 统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,数据以例数(率)表示,组间比较用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARMS法检测结果

232例肺腺癌标本EGFR基因突变104例,突变率为44.83%(104/232),其中19Del和L858R点突变分别占20.26%(47/232)和22.41%(52/232),19Del和L858R占总突变的95.19%(99/104);稀有突变为2.16%(5/232),1例L858R和T790M双突变;1例19Del和T790M双突变;1例G719X和L861Q双突变;1例20-Ins突变;1例L861Q。EGFR基因扩增曲线见图1。

图1 肺腺癌标本EGFR基因扩增曲线Figure 1 Amplification curves of EGFR gene in lung adenocarcinoma specimens

2.2 不同病理参数相互间比较

年龄≥60岁者突变率44.06%(63/143),年龄<60岁者突变率46.07%(41/89),两者EGFR基因突变率差异无统计学意义。手术切除标本突变率43.75%(7/16),肺活检标本突变率38.89%(49/126),恶性胸腔积液细胞块标本突变率62.86%(22/35),转移病灶标本突变率47.27%(26/55),不同标本类型突变率差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。男性患者突变率36.17%(51/141),女性患者突变率58.24%(53/91),女性患者的EGFR突变率高于男性,性别差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 EGFR基因突变率与临床病理参数的关系 例(%)

3 讨论

EGFR基因位于人类7号染色体的短臂上,包括28个外显子,其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。EGFR基因是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物,定位于细胞膜上。EGFR主要通过信号传导方式进入细胞核,可引起细胞核内基因转录水平增加,表达水平的增加可引起其下游信号传递过程异常,引起细胞生长加快,细胞生存期延长,同时抑制细胞凋亡,与肿瘤的发生发展、预后以及治疗反应等相关[6]。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是针对EGFR基因靶点的小分子抑制剂,多项临床试验已证实,EGFR基因突变的肺腺癌患者能从EGFR-TKIs治疗中显著获益[7,8]。因此,对肺腺癌患者进行EGFR基因突变状态的检测可预测其对EGFR-TKIs类药物的疗效。

目前,EGFR基因分型的检测方法多种多样,有荧光原位杂交法、高分辨率溶解曲线法[9]、罗氏Cobas系统实时PCR法[10]、微滴数字PCR法[11]、测序法[2]、ARMS法[2]等。各检测方法的差异主要表现在所用样本类型、肿瘤细胞含量、检测方法灵敏度和特异性、报告时限等,而临床上需要一种快速、灵敏、特异性高的检测方法。本研究所用ARMS法是基于PCR平台结合特异引物和双环探针两种技术,以达到对EGFR基因突变类型的高检测能力,检测突变类型多达29种。针对EGFR基因突变位点设计特异的突变检测引物,保证了其高度的特异性。且ARMS法灵敏度高,对标本肿瘤细胞DNA的含量及质量要求较低,可检测灵敏度低至1%的突变[12,13],因此,检测穿刺、活检小标本和胸水细胞块也得到理想的结果。该检测方法操作简易,结果直观易判读,仪器普及程度高,成本较低,目前已用于国内临床EGFR基因检测。

本研究结果显示,EGFR突变率为44.83%,在所有突变中,19Del和L858R突变率最高,占总突变率的95.19%;女性患者突变率(58.24%)明显高于男性(36.17%);年龄>=60岁者突变率(44.06%)与<60岁者(46.07%)相近;这些与王芳等[14]报道一致。EGFR基因在不同标本中的突变率,肺手术标本为43.75%、肺活检标本为38.89%、转移病灶标本为47.27%及胸水细胞块为62.86%均与Midha等[15]通过对全球文献分析发现中国人肺腺癌EGFR突变率在27%-66%的结果基本相符。从突变情况来看35例胸水细胞块EGFR的突变率高于肺手术标本、肺活检标本及转移病灶标本,突变率虽与陈轩等[16]报道一致,但这需要更多的标本例数去验证。Yatabe等[17]研究发现EGFR基因突变的异质性无论在原发灶、转移灶还是复发灶中都非常少见;也有研究表明肿瘤在分子水平上表现出异质性,且在肿瘤侵袭和转移过程中,EGFR基因状态也极不稳定,即转移灶与原发灶的基因状态常常不一致[18,19];因此转移病灶与原发灶EGFR基因突变的一致性需要更多病例及相关研究来证实。

实验过程中还需注意：①甲醛对DNA有交联作用，放置超过3个月的石蜡包埋样本中DNA片段化和降解较为严重，虽紫外分光光度计测量的浓度较高，但实际加入有效DNA量并不足，需要相应增加DNA用量。②虽然市售ARMS试剂盒可检测EGFR基因突变多达29位点，但对某些稀有或未知突变可能造成漏检，具有一定的局限性。③对于血性胸腔积液，制作细胞块前去红细胞处理和富集有核细胞层，可有效提高血性胸水细胞块DNA浓度与质量[20-22]。④对于失去手术机会的肺癌晚期患者，肺活检标本、转移病灶标本或胸水细胞块标本可替代手术标本进行EGFR基因检测，丰富了患者基因检测的取材途径。

综上所述,ARMS技术以简单、快速、灵敏度低至1%、特异性高、对样品无污染、可用于不同标本类型等优点,在评估肺腺癌EGFR突变类型方面具有较大的优势,为临床需要对EGFR-TKI药物敏感性的肺腺癌患者提供可靠的检测方法,是目前临床较有应用前景的检测方法。