基于生物信息学分析miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍发病机制中的作用*

孙加雯 张 帆 朱 萍 吴丽慧,2

注意缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactive Disorder，ADHD)是儿童时期最常见的精神疾病之一[1]，有研究显示每20名儿童中就有1名ADHD患儿[2]。患儿主要表现为注意力不集中、行为冲动和情绪波动，且约半数以上的患儿症状持续到成年等[2～4]，这就造成了ADHD患儿辍学率、成年后犯罪率和吸毒率较高，而教育程度和就业不足、收入相对较低[1,3]。目前的研究表明环境因素及遗传因素与ADHD的发生发展密不可分[5～7]，尽管有证据显示ADHD的遗传率约为80%[6]，但与大多数精神疾病类似，其病因机制尚不明确，有待进一步的科学研究。

microRNA(miRNA)是一种非编码保守的单链小RNA，miRNA基因通过转录，复合体修剪和酶切等一系列复杂过程形成成熟的miRNA，成熟的miRNA通过与靶基因的UTR区域的作用，抑制靶mRNA的翻译或促进靶mRNA的降解[8,9]。研究表明miRNA在神经系统中参与了轴突发育、树突发育、突触发生和神经元增殖等过程[9～11]，并在多种精神障碍性疾病的发病机制中发挥着重要作用。但miRNA在疾病中的精确作用途径仍然需要更深入的科学研究。

1 对象与方法

1.1 对象 前期研究发现了ADHD患儿血清中表达异常的miR-let-7d负向调控半乳凝素3(Galectin-3)进而抑制络氨酸羟化酶(TH)的表达，参与了ADHD的发生发展[12]。接着发现在ADHD动物模型SHR大鼠脑前额皮质中异常表达的miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494通过Nr3c1- Bhlhb2轴影响了ADHD的发生机制[13]。随后为了进一步研究miRNA在ADHD中的作用，收集了20例ADHD患儿和60名健康对照儿童的血清样本，通过miRNA芯片筛选出了表达差异有统计学意义的miRNA，其中miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641，fold change﹥2倍，经实时荧光定量PCR验证差异显著[14]。本研究基于前期的miRNA芯片筛选结果和ADHD患儿外周血中miR-30d-5p表达量差异，采用生物信息学的方法探讨miR-30d-5p在ADHD发病机制中的作用。

1.2 方法

1.2.1 miR-30-5p靶基因的预测 通过TargetScan7.2、miRDB和miRTarBase数据库对miR-30d-5p的靶基因进行预测，将三个数据库靶基因的交集用于后续的生物信息学分析。

1.2.2 miR-30d-5p靶基因的生物信息学分析 利用Cytoscape 3.7.1软件中的插件ClueGO对miR-30-5p的靶基因进行GO和KEGG富集分析，将P﹤0.05且富集基因数大于10个定义为有意义。

1.2.3 miR-30d-5p靶基因中关键基因的蛋白互作网络构建 利用Cytoscape 3.7.1软件中的插件STRING构建miR-30d-5p靶基因蛋白的互作网络(PPI)，依据插件cytoHubba中的连接度(degree)筛选出前10位关键基因(hub gene)。

1.2.4 miR-30d-5p靶基因与ADHD的联系 通过ADHDgene数据库(ADHDgene Database http:// adhd. Psych.ac.cn/ index.do)获取ADHD相关基因，基于miR-30d-5p靶基因的PPI利用插件cytoHubba构建33个ADHD相关基因的PPI，并与miR-30d-5p靶基因进行分析。

1.2.5 图像绘制 GO和KEGG富集图采用GraphPad Prism 8，韦恩图利用在线网站(BioVenn http://www.bio venn.nl/index.php)绘制。

2 结果

2.1 miR-30-5p靶基因的预测 在TargetScan7.2数据库中获得miR-30d-5p预测靶基因1 579个，miRDB数据库中1 539个，miRTarBase数据库中369个。取三个数据库的两两交集去掉重复后共有1 142个靶基因纳入研究。见图1。

图1 miR-30d-5p预测靶基因韦恩图

2.2 miR-30d-5p靶基因的GO功能和KEGG信号通路富集分析 基于ClueGO插件对筛选出的1 142个靶基因的GO功能富集分析显示miR-30d-5p靶基因定位到核质、细胞内细胞器、轴突、细胞膜等细胞结构，并在神经系统中广泛参与到神经元发育、分化、神经元发生的调节、神经元投射发育、顺式调控区结合及顺式调控区序列特异性DNA结合等生物过程，(P值经Bonferrioni矫正后优先选取神经系统相关的前10项进行展示)。见图2。KEGG信号通路富集显示靶基因主要富集在FoxO信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路这4条通路中。见图3。

2.3 靶基因中关键基因的PPI网络构建 通过Cytoscape 3.7.1软件中的插件STRING构建miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI，依据插件cytoHubba中的degree筛选出了NOTCH1、KRAS、SIRT1、MAPK8、SOCS3、NEDD4、SKP2、BDNF、NEDD4L、SOCS1前10位关键基因。见图4。

注：BP: Biological Process生物过程；CC: Cellular Component细胞组成；MF: Molecular Function分子功能

图3 miR-30d-5p靶基因KEGG信号通路富集分析

图4 miR-30d-5p靶基因PPI中的关键基因

2.4 miR-30d-5p靶基因与ADHD的联系 miR-30d-5p靶基因与ADHDgene数据库中基因对比发现，靶基因中有33个基因与ADHD的发病机制相关。见图5。基于miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI构建33个靶基因PPI网络图。筛选出的关键基因中的BDNF为ADHD发病机制相关基因。见图6。表明miR-30d-5p可能作用于靶基因BDNF参与ADHD的发生发展。

图5 miR-30d-5p靶基因与ADHD数据库基因韦恩图

3 讨论

ADHD作为儿童时期最常见的精神障碍性疾病之一[1]，近年来发病率呈增高的趋势[15]。在对ADHD环境致病因素的研究中发现早产、低出生体质量、孕妇吸烟和饮酒以及暴露于环境毒素中(如铅、有机磷农药等)等一系列环境问题均会增加儿童的患病率[16]。在基因遗传致病方面从最初的ADHD候选基因的挖掘到全基因组关联研究(GWAS)、基因拷贝数变异(CNV)研究以及核苷酸多态性研究等[17]，虽然都为ADHD的病因机制做出了一定的贡献，但到目前为止关于ADHD的病因机制仍然不明确。

miRNA作为一种非编码保守的单链小RNA ，其特定的干扰功能参与了DNA甲基化、RNA编辑和组蛋白修饰等生物学过程，影响多种精神疾病的发生发展[18]。一项关于精神分裂症的研究中发现，患者背外侧前额叶皮层中高表达的miR-16抑制了RGS4基因的表达，进而导致了G蛋白偶联受体介导的N-甲基-d-天冬氨酸受体活性的降低 ，影响了该疾病的发展[19]。在对自闭症的研究中发现，患者外周血中异常表达的miR-486-3p抑制了神经分化相关基因ARID1B的表达，从而干扰了认知信号通路的建立[20]。在miRNA与ADHD方面，本课题组首先将miRNA引入到了ADHD的研究中，发现了患儿表达异常的miR-let-7d调控 Galectin-3抑制TH的表达，进而影响了ADHD的发生发展[12]。随后在一项对ADHD患儿外周血全基因组miRNA表达分析中发现差异表达的miR-26b-5p、miR-185-5p和miR-191-5p可以通过改变肌醇信号通路在ADHD发病中起重要作用[21]。一系列的研究都表明了miRNA在精神障碍性疾病的发病中具有重要作用。在前期的研究中也显示ADHD患儿外周血中存在部分差异表达miRNA，其中患儿组miR-30d-5p的表达量较对照组降低(fold change﹥2倍)[14]。通过对miR-30d-5p预测靶基因的GO富集分析发现大量的靶基因富集在神经系统的发育、神经元的分化、神经元投射发育、投射发育的调节等生物过程，同时KEGG信号通路富集的FoxO信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路也都在神经系统中发挥着重要作用。有趣的是Maffioletti E等[22]在双相情感障碍患者的外周血中也发现了miR-30d-5p的差异表达，Díez-Planelles C等[23]在亨廷顿病患者外周血的检测中同样发现了miR-30d-5p的差异表达,并且两人的网络分析都表明miR-30d-5p在神经系统中具有重要作用[22，23]。综上，不论他人的研究结果还是本课题组前期研究及本研究结果都暗示了miR-30d-5p的异常表达可能参与部分精神障碍性疾病的发病。

图6 靶基因中33个ADHD相关基因PPI

脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)是一种内源性、小型分泌蛋白，其编码的基因首先翻译成 32 kD 的前体蛋白pro-BDNF，然后通过细胞外的前激素转换酶的酶切和高尔基复合体的加工等过程，形成具有生物活性的14 kD 成熟蛋白，成熟的BDNF蛋白能够与高亲和力酪氨酸激酶受体(Trk)B受体和低亲和力神经营养因子受体(P75NTR)结合，促进神经细胞的生存与增殖、轴突生长和分化，参与突触可塑性的调节[24]。有动物研究表明条件性BDNF基因敲除的小鼠具有过度活跃的行为表现，而这种表现正是ADHD的典型症状之一[25]。随后在ADHD大鼠模型中观察到，与对照组大鼠相比，ADHD模型大鼠的海马区BDNF和TrkB表达减少，而经跑步机运动治疗和盐酸哌甲酯(MPH)给药治疗可以增加脑部的BDNF，缓解模型大鼠的空间学习能力缺陷的症状[26，27]。这与ADHD患儿学习障碍和药物治疗相匹配。在ADHD患儿的研究中发现BDNF基因功能Val66Met、rs11030101和rs10835210多态性与ADHD存在相关性[28，29]。但在一项包含3 594例ADHD患者和4 040名对照的Mate分析研究中显示Val66Met多态性与ADHD缺乏相关性[30]。同时关于BDNF在外周血中的表达与ADHD关系的研究也呈现出不一致性。有报道显示未经治疗的ADHD患儿血浆BDNF水平升高，并且血浆中BDNF水平与注意力不集中症状的严重程度呈正相关[31～33]，同时ADHD患儿在接受MPH治疗2个月后血浆中BDNF水平与健康对照组水平相似[33]。但Scassellati C等[34]的研究中并未发现外周血中BDNF的水平与ADHD的相关性。ADHD与 BDNF之间是存在相关性的，由于ADHD病因机制的复杂性，研究人群的差异性以及样本的不稳定性等一系列客观因素造成了研究结果的差异性。关于两者的关系不应以BDNF单一因素去研究，在ADHD相关基因的PPI中(见图6)也不难看出BDNF与其他ADHD相关基因的互作联系，这表明BDNF作用于ADHD机制也存在一定的复杂性。

综上本研究在前期大量工作的基础上采用生物信息学的方法探讨miR-30d-5p在ADHD中的作用机制，并构建了关键靶基因的PPI，通过ADHD gene数据库对比发现miR-30d-5p -BDNF-ADHD三者之间潜在的联系，即miR-30d-5p可能通过靶向调控BDNF基因参与ADHD发生发展的过程，miR-30d-5p可能作为ADHD临床诊疗的分子指标，但该分析结果还有待进一步实验验证。总之本研究对ADHD的病因机制作了进一步补充，同时也为miRNA作为诊疗指标提供了依据。