具核梭杆菌通过下调LCN2 促进结直肠癌细胞增殖和迁移

朱畅，傅宇翔，夏利刚，李方，黄凯斌，孙逍

结直肠癌是全球最常见的癌症之一，是全球癌症死亡的第三大原因［1，2］。在中国结直肠癌发病率较高，男性中结直肠癌发病率仅次于肺癌、胃癌，而在女性中发病率也仅次于乳腺癌和肺癌［3］。结直肠癌是一种多因素疾病，饮食、年龄、饮酒、吸烟、体育活动和体质指数［1，2］等危险因素均有可能诱使结直肠癌发生。研究表明，肠道微生物群的组成和功能在调节结直肠癌患病风险中发挥着重要作用［3-7］。由于肠道微生物群的复杂性［8-10］，以及个体和群体内部之间的多样性［11］，寻求识别与癌症发病率相关的特定细菌特征的研究尚未取得成功［12］。然而，元基因组学研究表明，某些细菌种类的存在与结直肠癌有关［9］。研究证实，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）在结直肠癌粪便和粘膜样本中含量较高，增加了其在致癌过程中发挥致病作用的可能性［13-16］，但具体的作用机制仍不清楚。本研究旨在探索具核梭杆菌的参与结直肠癌发生发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象选取来自深圳市人民医院门诊的肠镜受检者，结直肠癌和健康对照人群来自同一地区，饮食和生活方式相似，两组受试者的年龄、性别、体质指数（BMI）等无统计学差异。所有结直肠癌患者在采样前1 个月均未用过微生态制剂和抗生素，健康对照人群采样前无消化道疾病，也未使用过微生态制剂和抗生素。本研究分组情况为：15 例结直肠癌患者手术前为术前组，接受结直肠癌手术后3个月结肠镜复查正常为术后组；15例无结直肠疾病的健康对照组。分别收集结直肠癌患者手术前3 天和术后3 个月、健康个体的粪便样本用于具核梭杆菌丰度检测。

1.2 材料

结直肠癌细胞系HCT116、SW480 和具核梭杆菌ATCC25586 菌株购自美国ATCC，QIAmp DNA粪便试剂盒购自德国Qiagen 公司；SYBR GreenRe⁃altime PCR Master Mix 购自赛默飞公司；无菌粪便管购自德国Sarstedt 公司；转录组微阵列分析交由北京基石生命科技有限公司完成；引物序列由上海生工合成；all⁃in⁃one miRNA qRT⁃PCR检测试剂盒购自GeneCopoeia 公司；CCK⁃8细胞计数试剂盒购自美国Glpbio；TRIzol 试剂购自美国Invitrogen 公司；pGL3⁃Basic 载体和逆转录试剂盒来自美国Promega公司；DMEM 培养基购自美国Gibco；LCN2 慢病毒载体构建及包装由北京海创科业生物科技有限公司完成；LCN2和actin一抗及对应的含辣根过氧化物酶二抗购自CST 公司；ABI Step one Plus Real⁃time PCR 系统购自美国ABI 公司。

1.3 样品储存和具核梭杆菌DNA 分离

所有粪便样本均收集于无菌粪便管中，在-80℃冷冻至DNA 提取。按照制造商说明书，采用Qiagen 提供的QIAmp DNA 粪便试剂盒从样本中提取基因组DNA（gDNA），并保存在-80℃待用。

1.4 qPCR 检测具核梭杆菌丰度

通过qPCR 检测16SrRNA 基因来检测具核梭杆菌相对丰度。取80 ng gDNA 模板、SYBR Green⁃Realtime PCR Master Mix，和终浓度为0.4 μM 的引物振荡混匀，配成20 μL 反应体系进行qPCR，扩增采用ABI Step one Plus Real⁃time PCR 系统，反应条件为：95 ℃，10 min，然后95 ℃循环40 次，每次15 s，最后60 ℃反应1 min。将prostaglandintrans⁃porter（PGT）基因用作内参［17］，计算具核梭杆菌的相对丰度。

Fn（sense）：5′⁃ CAACCATTACTTTAACTCTAC⁃CATGTTCA⁃3′，（antisense）：5′⁃ GTTGACTTTACAG⁃AAGGAGATTATGTAAAAATC⁃3′；内参PGT（sense）5′⁃ATCCCCAAAGCACCTGGTTT⁃3′，（antisense）：5′⁃AGAGGCCAAGATAGTCCTGGTAA⁃3′［18］。

1.5 细胞培养、Fn 感染与载体构建

将结直肠癌细胞系HCT116 和SW480 放至含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，37℃，5% CO2恒温培养箱中培养。对于Fn 感染实验，细胞在不含抗生素的培养基中培养，并与Fn 以感染复数MOI（1∶100）进行孵育24 h，以不感染Fn 的结直肠癌细胞为Control 组，感染Fn 为Fn⁃infected 组。按照实验指导说明，将含有LCN2 的慢病毒转染结直肠癌细胞HCT116 和SW480，分为NC 组、OE⁃LCN2 组和OE⁃LCN2+Fn⁃infected 组。

1.6 qRT⁃PCR

用TRIzol 试剂分离提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，使用SYBR Green引物进行定量逆转录聚合酶链反应（qRT⁃PCR），每个样品三个重复。Actin 作为标准化内参，相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。使用引物如下：LCN2（sense）：5′⁃AAGATACCTTAGTAGGTACTAACATT⁃3′；（antisense）：5⁃CCACGGATCTTACCCGGA⁃ 3′。Actin（sense）：5′⁃ TACGGAATGAACCTGACCATT ⁃3′；（antisense）：5′⁃GGACCATCATGCTAGCATCTGA⁃3′。

1.7 Western blotting

提取总蛋白，将热变性的蛋白样品点至10%SDS⁃PAGE 胶中，电泳结束后，转移到PVDF 膜。用TBST 配制的5%脱脂牛奶封闭，与一抗在4℃孵育过夜，再与二抗在室温下孵育2 h。TBST 洗涤后，使用增强型化学发光试剂检测荧光信号。

1.8 细胞增殖实验

将细胞以1.5×103/孔加入到96 孔板中，Fn 转染后，恒温培养箱继续培养48 h。每孔加入10 μL，浓度为5 mg/mL 的CCK⁃8 溶液，继续37℃恒温培养4 h 后，酶标仪测定450 nm 处吸光度值，以时间为横坐标，相对于Control 组的细胞存活率为纵坐标。

1.9 Transwell 迁移侵袭实验

将Transwell 小室放入24 孔板中，上室加入200 μL 细胞浓度为1×103个/mL 的无血清单细胞悬液，下室加入500 μL 含20%血清的培养基，放入5% CO2、37℃恒温培养箱中培养16 h，取出小室，用0.01%的DAPI 染色，倒置显微镜拍照。侵袭实验须将Matrigel 胶与4℃预冷的无血清培养基按照1∶3 的比例稀释混匀，然后将稀释后的溶液加入到上室内，其余步骤与迁移实验相同。

1.1 0 统计分析

采用SPSS 20.0 分析处理数据。计量数据以均值±标准差表示，两组独立组均值间差异采用t检验，多组均值间采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结直肠癌患者手术前后具核梭杆菌丰度对比

定量PCR 检测15 例术后3 个月结肠镜复查正常的结直肠癌患者手术前后，以及15 例正常健康个体的粪便样品中的具核梭杆菌丰度，分析结果显示这些结直肠癌患者术后具核梭杆菌丰度明显降低，而术后组中具核梭杆菌丰度与健康组则无显著差异。这些结果提示具核梭杆菌与结直肠癌存在可能的临床相关性。

2.2 具核梭杆菌促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

将具核梭杆菌感染结直肠癌细胞，观察具核梭杆菌对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果显示，结直肠癌细胞感染具核梭杆菌后，细胞增殖活性升高，迁移和侵袭细胞能力增强，提示具核梭杆菌能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

图1 结直肠癌患者手术前后及正常健康个体中具核梭杆菌丰度对比

图2 具核梭杆菌促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭 A：CCK⁃8 检测具核梭杆菌对结直肠癌细胞HCT116 和SW480增殖活性的影响；B：Transwell 检测具核梭杆菌对结直肠癌细胞HCT116 和SW480 迁移和侵袭的影响

2.3 具核梭杆菌抑制结直肠癌细胞中LCN2的表达

针对具核梭杆菌感染前后的HCT116 细胞进行转录组微阵列分析，结果显示具核梭杆菌使结直肠癌细胞中多个基因发生了不同程度的差异表达，其中LCN2 是Fn 感染结直肠癌细胞后表达最具显著差异的基因，其表达受到抑制（图3A）。为了验证微阵列检测结果，我们进一步采用qPCR和Western blot 分析，结果显示Fn 感染HCT116 和HT29 细胞后，LCN2 mRNA 水平和蛋白表达均下调（P＜0.01，图3B，C）。

图3 具核梭杆菌下调结直肠癌细胞LCN2 的表达 A：微阵列分析具核梭杆菌影响结直肠癌细胞基因的差异表达；B：qPCR 检测具核梭杆菌对结直肠癌细胞中LCN2 相对mRNA 表达的影响；C：Western blot 检测具核梭杆菌对结直肠癌细胞中LCN2 蛋白表达的影响；**P＜0.01

2.4 LCN2 抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

LCN2 对结直肠癌细胞发挥什么作用呢，我们在结直肠癌细胞中过表达LCN2，并通过CCK⁃8 和Transwell 实验检测了LCN2 对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。图4 结果显示，过表达LCN2抑制了结直肠癌细胞增殖活性和迁移侵袭能力，但具核梭杆菌感染后却能够减弱LCN2 过表达对结直肠癌细胞的抑制效应，使得结直肠癌细胞增殖活性、和迁移侵袭能力一定程度上恢复。因此，以上结果提示具核梭杆菌可能通过降低LCN2 的表达而促进结直肠癌细胞的增殖和迁移。

图4 LCN2 抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭 A：Western blot 检测结直肠癌细胞中LCN2 的蛋白表达；B：CCK⁃8 检测LCN2 对结直肠癌细胞增殖活性的影响；C：Transwell 检测LCN2 对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响；*P＜0.05，**P＜0.01

3 讨 论

越来越多的研究表明肠道菌群与结直肠癌相关，参与结直肠癌的发生发展。具核梭杆菌是一种革兰氏阴性厌氧菌，研究显示具核梭杆菌与结直肠癌的发生发展相关［16］，但具核梭杆菌参与结直肠癌的作用机制仍不清楚，因此，本研究旨在探究肠道细菌具核梭杆菌影响结直肠癌发生发展的可能机制。在本研究中，我们比较了来自同一地区，背景相似的15 个术后恢复良好的结直肠癌患者术前、术后的粪便样本和15 个健康受试者的粪便样本，结果显示，具核梭杆菌在术前组中丰度相对较高，而在术后组与健康组中丰度较低，说明具核梭杆菌与结直肠癌存在相关可能性。

为了验证具核梭杆菌与结直肠癌细胞的关系，本研究将具核梭杆菌感染结直肠癌细胞，发现具核梭杆菌能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。据报道，微生物群影响结直肠癌细胞的一个潜在机制是通过影响细胞基因的表达［19，20］。因此，我们推测具核梭杆菌可能也是通过影响结直肠癌细胞相关基因的表达来参与结直肠癌的发展。通过微阵列分析发现具核梭杆菌丰度与LCN2 表达负相关，通过进一步验证发现具核梭杆菌能够抑制LCN2 mRNA 和蛋白表达，并通过下调LCN2 来促进结直肠癌细胞的增殖活性以及迁移与侵袭能力。然而，具核梭杆菌调控LCN2 表达的具体机制仍需进一步去探究。

LCN2 是由肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞分泌的胞内可运输铁离子的蛋白质，通过调控铁离子运输参与肿瘤相关的信号通路，从而影响肿瘤细胞的增殖和迁移。但据报道，LCN2 在不同的肿瘤中发挥的作用有所不同，如敲除LCN2 后，高迁移侵袭前列腺癌细胞系PC3 增殖能力减弱［21］，而也有研究发现LCN2 抑制结直肠癌细胞增殖和肿瘤生长［22，23］，LCN2 在转移性结肠癌中的表达低于非转移性结肠癌［23］，本研究结果也显示LCN2 能够抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Feng 等［22］研究发现，LCN2 通过抑制NF⁃kβ/snail 信号通路，抑制上皮细胞向间质细胞的转变，从而影响结直肠癌细胞的侵袭转移能力。因此，LCN2 可作为结肠癌潜在的治疗靶标。

综上，具核梭杆菌可以通过降低LCN2 对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用来促进结直肠癌细胞的恶性发展，为LCN2作为与具核梭杆菌相关的结直肠癌的预防和治疗靶点提供了理论依据。