川续断皂苷Ⅵ经ATF6通路对H9c2心肌细胞氧化应激和凋亡的保护作用

冯海斌，张巍，李琴，柴巧英，韩继如，李娟

氧化应激(OS)是促进细胞凋亡的重要因素，并涉及多种心血管疾病的病理生理，如缺血/再灌注损伤、动脉粥样硬化、心力衰竭和高血压[1-2]。OS表现为活性氧(ROS)的过度产生，后者破坏细胞的氧化还原平衡和内质网蛋白质折叠环境的稳态，最终导致细胞死亡和器官功能障碍等一系列事件[3]。要恢复内质网稳态，细胞会激活未折叠的蛋白质反应(UPR)信号通路，这些通路由活化转录因子6(ATF6)、肌醇需求激酶1α(IRE1α)和蛋白激酶样内质网激酶(PERK)调节[4]。因此，每个UPR通路的差异调节可能是治疗心血管疾病的一种治疗策略。研究表明，ATF6的激活可增加内质网驻留蛋白的表达，从而避免错误折叠的蛋白，包括葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、GRP94和蛋白二硫化物异构酶A6(PDIA6)[5]。此外，ATF6的激活还诱导抗OS基因[6]。这些研究表明，ATF6对OS具有重要的保护功能。川续断皂苷Ⅵ是川续断的主要活性成分，具有抗氧化和抗炎等生物学效应，可以保护新生大鼠心肌细胞免受过氧化氢(H2O2)诱导的损伤，但其机制尚不清楚[7]。因此，本研究探讨川续断皂苷Ⅵ对H9c2心肌细胞氧化应激和凋亡的保护作用及机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞： H9c2心肌细胞(上海生命科学研究院细胞库)。(2)试药试剂：川续断皂苷Ⅵ(四川省维克奇生物科技有限公司，纯度 99.9%)；30% H2O2(江苏凯基生物技术股份有限公司)，胎牛血清和RPMI-1640培养基(美国Invitrogen公司)，细胞计数试剂盒8 (CCK-8,美国Amresco公司)；2' 7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、 乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；ECL试剂盒、细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒和细胞蛋白抽提试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯膜(碧云天生物技术研究所)；B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl关联性X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、ATF6、GRP78、PDIA6和GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗小鼠IgG抗体(武汉艾美捷科技有限公司)。(3)仪器：EliteⅡ型CO2培养箱(美国Thermo Revco公司)，S-450D型超声波细胞破碎仪(美国BRANSON公司)，HBS-1096B型酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，DYCZ-28型BD垂直电泳仪和BD FACSCanto型流式细胞仪(美国BD公司)；BioSpectrum型凝胶成像仪(美国UVP公司)。

1.2 细胞培养及实验分组 2019年6—9月于邯郸市第一医院实验室进行实验。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5% CO2下培养H9c2细胞，当细胞融合率达到80%时进行实验。实验分为对照组、H2O2组及川续断皂苷Ⅵ低、中、高剂量组。对照组加入无血清RPMI-1640培养基，H2O2组加入终浓度为200 μmol/L的H2O2，川续断皂苷Ⅵ低、中、高剂量组加入终浓度为25、50、100 μmol/L的川续断皂苷Ⅵ，同时给予终浓度为200 μmol/L的H2O2，继续培养24 h后进行相关检测[8-9]。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 CCK-8 法检测H9c2细胞增殖率：将H9c2细胞以5×103个/孔接种于96孔板中(200 μl /孔)，待细胞融合后，按上述实验方法给予川续断皂苷Ⅵ和H2O2进行干预20 h，向培养板中加入 CCK-8试剂10 μl，37℃继续培养4 h，用酶标仪在630 nm处测定吸光度值(OD值)，计算细胞增殖率(细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值)。

1.3.2 H9c2细胞凋亡率检测：将H9c2细胞以5×104个/孔接种于6孔板内(3 ml/孔)，待细胞融合后，按上述实验方法给予川续断皂苷Ⅵ和H2O2进行干预24 h，根据细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒说明书检测细胞凋亡。

1.3.3 H9c2细胞内ROS、LDH和MDA的测定：将H9c2细胞以5×104个/孔接种于6孔板内(3 ml/孔)，待细胞贴壁后，按上述实验方法给予川续断皂苷Ⅵ和H2O2进行干预24 h，弃培养基，采用DCFH-DA探针联合酶标仪法检测细胞内ROS水平；接种孔内加入磷酸盐缓冲液2 ml，用超声波细胞破碎仪处理30 s，离心收集上清液，按试剂盒说明书检测细胞中LDH、MDA水平。

1.3.4 H9c2细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3、ATF6、GRP78和PDIA6水平检测：采用Western-blot法检测。将H9c2细胞以5×104个/孔接种于6孔板内(3 ml/孔)，待细胞贴壁后，按上述实验方法干预24 h，弃培养基，根据细胞量加入细胞蛋白抽提液，裂解2 h；离心取上清进行蛋白定量；调整蛋白浓度，加入1/5体积的5×Buffer，沸水进行变性，进行电泳(每孔上样量为20 μg)，将印迹转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶在室温下封膜1 h，将膜与Bcl-2(1∶200)、Bax(1∶400)、Caspase-3(1∶300)、ATF6(1∶500)、GRP78(1∶200)、PDIA6(1∶500)和GAPDH(1∶5 000)抗体进行孵育，4℃过夜，用TBST缓冲液对膜进行2次冲洗，将膜与辣根过氧化物酶HRP标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)在室温下孵育30 min。进行显色，采集图像进行分析。采用ECL染液进行显色，然后用BioSpectrum型凝胶成像仪定量分析蛋白表达强度，以GAPDH表达作为内控。

2 结 果

2.1 各组H9c2细胞增殖和凋亡比较 与对照组比较，H2O2组H9c2细胞增殖率降低，凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，各川续断皂苷Ⅵ组H9c2细胞增殖率升高，凋亡率降低，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组H9c2细胞增殖和凋亡情况比较

2.2 各组H9c2细胞内ROS、LDH和MDA水平比较 与对照组比较，H2O2组H9c2细胞内ROS、LDH和MDA水平均升高(P<0.01)；与H2O2组比较，各川续断皂苷Ⅵ组H9c2细胞内ROS、LDH和MDA水平均降低，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。

表2 各组H9c2细胞内ROS、LDH和MDA水平比较

2.3 各组H9c2细胞内Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比较 与对照组比较，H2O2组H9c2细胞内Bcl-2水平降低，Bax和Caspase-3水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，各川续断皂苷Ⅵ组H9c2细胞内Bcl-2水平增加，Bax和Caspase-3水平降低，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3、图2。

表3 各组H9c2细胞内Bcl-2、Bax和Caspase-3水平比较

2.4 各组H9c2细胞内ATF6、GRP78和PDIA6水平比较 与对照组比较，H2O2组H9c2细胞内ATF6、GRP78和PDIA6水平均降低(P<0.01)；与H2O2组比较，各川续断皂苷Ⅵ组H9c2细胞内ATF6、GRP78和PDIA6水平增加，且呈剂量依赖性，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图3。

表4 各组H9c2细胞内ATF6、GRP78和PDIA6水平比较

3 讨 论

研究表明，川续断皂苷Ⅵ通过限制脑缺血/再灌注损伤，增加微血管数量并改善脑缺血后的血流发挥神经保护作用[10]。川续断皂苷Ⅵ还可减轻H2O2诱导的PC12细胞凋亡和ROS水平的增加，并增强局灶性脑缺血大鼠皮质组织中抗氧化酶的活性[11]。然而，川续断皂苷Ⅵ对心肌细胞氧化损伤的作用及其机制尚不清楚。H9c2是源自BD1X大鼠心室的克隆细胞系，具有许多心肌的电生理、离子通道和受体等特性[12]。H2O2诱导的H9c2细胞模型已被广泛用于确定心脏氧化损伤的发病机制及其治疗策略[13]。本研究单独用H2O2处理可以显著增加H9c2细胞中ROS、LDH和MDA水平，用川续断皂苷Ⅵ处理后能减弱H2O2对H9c2细胞的损伤，表明川续断皂苷Ⅵ具有抗氧化作用。

ROS直接破坏细胞结构、核酸、脂质和蛋白质，并引发一系列事件，加剧细胞损伤，参与了与炎性反应、代谢和凋亡相关的细胞内信号级联。研究发现，ROS的过度生成会影响内质网的稳态，干扰蛋白质的正确折叠，最终启动内质网应激介导的凋亡通路，加重心肌细胞损伤[14]。在严重内质网应激条件下，促凋亡的转录因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)被强烈诱导。CHOP的激活改变了凋亡相关蛋白，如Bax和Bcl-2[15]。Bcl-2和Bax基因在决定细胞凋亡后的存活或死亡中起主要作用。Caspase-12是内质网应激诱导凋亡的另一种主要凋亡相关蛋白，其激活间接激活了胞质Caspase-3，Caspase-3是诱导细胞死亡的主要效应蛋白酶[16]。本研究中川续断皂苷Ⅵ处理抑制了H2O2的作用，降低了细胞凋亡率、Bax和Caspase-3水平，增加了细胞增殖率、Bcl-2水平，表明川续断皂苷Ⅵ对H2O2诱导损伤的保护作用涉及抑制内质网应激介导的细胞凋亡，和上述文献研究一致。

内质网应激最初会触发一个适应性UPR过程以恢复内质网稳态，如果内质网应激未能解决，则UPR会抑制适应性反应并触发细胞凋亡。3种ER跨膜蛋白，即ATF6、IRE1a和PERK，通过靶向不同的基因来动员UPR。研究发现，银杏内酯K通过激活IRE1a信号来保护心脏免受衣霉素诱导的内质网应激[17]；PERK激活在β-淀粉样蛋白诱导的内质网应激下恢复细胞内环境平衡中起重要作用[18]。与IRE1a和PERK相反，在心肌缺血/再灌注期间，UPR的ATF6通路在响应ROS介导的内质网应激中起主要作用[19]。在体内和离体模型及培养的心肌细胞中，ATF6表达上调对缺血/再灌注损伤具有保护作用。使用转基因小鼠模型的研究表明，激活ATF6可保护心脏免受缺血/再灌注损伤[20]。ATF6激活会结合内质网应激反应元件，导致ATF6诱导的内质网蛋白(如GRP78、GRP94和PDIA6)的表达增加[21]。预先诱导的GRP78保护心肌细胞免于OS诱导的细胞死亡，并且H9c2细胞中GRP94过表达减少了应激诱导的细胞死亡；PDIA6通过增强内质网蛋白折叠，保护心肌细胞免受缺血/再灌注诱导的细胞死亡[22-23]。此外，对小鼠心脏中ATF6基因缺失的研究表明，内源性ATF6对缺血/再灌注损伤具有重要的保护作用，因为它是诱导多种抗氧化剂蛋白[如过氧化氢酶(Catalase，CAT)]所必需的。CAT中和了ATF6中大量的ROS，通过将H2O2转化为O2和水，从而减轻OS损伤[24]。本研究结果显示，川续断皂苷Ⅵ处理激活了H2O2处理的H9c2细胞中ATF6及其下游基因GRP78和PDIA6水平升高，表明川续断皂苷Ⅵ通过ATF6通路发挥心肌细胞保护作用。

综上所述，川续断皂苷Ⅵ通过激活ATF6通路，减轻H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激和抑制细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用，为川续断皂苷Ⅵ治疗心肌损伤的开发提供理论基础。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

冯海斌：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张巍：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；李琴：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；柴巧英：进行统计学分析；韩继如、李娟：课题设计，论文撰写