截短型潜态相关肽对TGF-β诱导HSC-T6细胞增殖的影响

于 洋，曹雅男，宋旭东，苏晓男，史嘉翊，吴 丹

(牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江 157011)

肝纤维化(Liver fibrosis)是大多数慢性肝病的组织学特征，可发展为肝硬化和肝衰竭[1]。主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)大量沉积，肝纤维化状况可以用来评估肝病的严重程度[2]。肝纤维化早期可被逆转，因此及时有效的干预可以减少肝病的发生、发展[3]。目前认为大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖是导致肝纤维化的关键过程[4]。转化生长因子TGF-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)是潜在的纤维化形成细胞因子，能够促进HSC活化[5]，与肝纤维化形成有关。TGF-β最初由位于N端的LAP与成熟型TGF-β以非共价键结合形成复合物的形式存在，该复合物不具有生物活性。当释放至胞外时，受蛋白酶或整合素作用，使LAP裂解或者改变其空间构型，具有活性的成熟型的TGF-β才被释放，发挥生物活性[6]，因此LAP蛋白对TGF-β活化至关重要。

本实验室前期设计7个LAP截短的引物序列，利用基因工程技术，扩增全长及截短LAP有效片段。本实验小量试诱导表达截短型LAP-B重组蛋白，并纯化目的多肽，考察LAP截短型多肽对HSC-T6细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料7个LAP重组质粒、大肠杆菌C43感受态细胞(牡丹江医学院医药研究中心)，细胞株HSC-T6(中国科学院上海细胞库)。

1.2 主要试剂与仪器酵母提取物、蛋白胨(Oxoid公司)；氯化钠(Solarbio公司)；咪唑(Imidazole) (Solarbio公司)；异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG) (biofroxx公司)；苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) (Thermo Scientific公司)；镍亲和层析柱(Ni-NTA Agarose) (上海凯杰生物有限公司)；蛋白分子量Marker(Bio-rad公司)；胰蛋白酶、DMEM、胎牛血清(HyClone公司)；MTT试剂(Solarbio公司)；离心机、恒温培养摇床(Eppendorf公司)；倒置生物显微镜(Olympus公司)；二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 LAP重组质粒转化C43感受态细胞及诱导表达检测 分别将1μL的LAP重组质粒加入到50μL的C43中，放置冰上30min。42℃水浴中90s进行热休克后迅速放回冰中，静置2min。在超净工作台中加入400μL LB培养基(不含抗生素)轻轻混匀，固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。取上述转化混合液200μL，分别添加到终浓度为50μg/mL卡那霉素固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的涂布棒涂布均匀，放入37℃恒温培养箱中培养12～14 h。挑取7个截断型LAP重组质粒阳性克隆于5mL LB液体培养基中，37℃恒温摇床中过夜培养。次日将过夜培养的菌液按1:200比例分别接种于10mL LB培养基中，37℃恒温摇床培养4h至OD600为0.8，添加终浓度为0.3mM的IPTG 37℃诱导16h。将过夜培养的菌液4℃，4000rpm离心15min后弃上清，收集的菌体用500μL重悬液(25mmol/L Tris 8.0, 200mmol/L NaCl)重悬，加入2mM PMSF，置冰水浴中超声破碎菌体，功率调为80w，超声工作频率为工作3s，停歇5s，共5次。4℃，13000rpm离心40min收集上清。将上清与30μL镍柱琼脂糖凝胶(Ni-NTA Beads)置于4℃层析柜结合1h，离心弃上清，加入500μL的清洗液(25mmol/L Tris, 200mmol/L NaCl，15mmol/L Imidazole)清洗杂蛋白，重复2次。分别取Ni Beads 20μL，将样品加入5SDS上样缓冲液煮沸10min，SDS-PAGE电泳检测。

1.3.2 重组截短型LAP-B蛋白的大量诱导表达及纯化 将培养的截短型LAP-B菌液按1:200的比例接种于5mL的LB液体培养基中，按1.3.1进行诱导蛋白及镍柱亲和纯化。上清全部通过镍层析柱并清洗杂蛋白后，加6mL洗脱液(25mmol/L Tris 8.0，200mmol/L NaCl，300mmol/L Imidazole)洗脱目的蛋白，静置30min，收集洗脱液，重复2次。将纯化后的目的蛋白用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-80℃保存。取样进行SDS-PAGE检测。

1.3.3 HSC-T6细胞传代培养 细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次，加0.25%胰蛋白酶消化约1min，倒置显微镜下观察细胞回缩变圆时加入培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，沉淀培养基重悬，按1∶2比例分瓶传代，放入37℃，5% CO2细胞培养箱中培养；待细胞完全贴壁后，进行换液培养或传代。

1.3.4 MTT检测LAP-B对TGF-β诱导的HSC-T6细胞增殖的影响 将培养瓶的细胞用胰蛋白酶消化后，计数细胞，96孔板中接种HSC-T6细胞0.5×104个/孔，体积为100μL，并设置5个复孔。实验设有空白对照组、TGF-β活化组、6个不同浓度的重组蛋白LAP-B给药组(2、4、8、16、32、64μg/mL组)，TGF-β活化组和LAP-B给药组均给予TGF-β 10ng/mL活化细胞。药物作用时间达到72h后，加入MTT溶液20μL，孵育4h后加DMSO 150μL，震荡10min，检测OD490的吸光度值。

2 结果

2.1 截短型LAP各个片段的组成信息人源LAP片段大小为747 bp，本实验室前期设计的7个截短型LAP片段，LAP-A为(1-411 bp)、LAP-A1为(1-195 bp)、LAP-A2为(1-300 bp)、 LAP-A4为(229-441 bp)、LAP-B为(229-747 bp)、LAP-B2为(577-747 bp)、LAP-C为(229-576 bp)，见图1。利用基因克隆构建了这些LAP片段的原核表达载体。本实验将这些重组质粒转化至大肠杆菌C43中。

图1 LAP截短蛋白重组信息

2.2 LAP重组蛋白小量诱导表达检测7个LAP重组质粒进行转化后进行小量37℃培养，IPTG低温诱导表达，超声破碎离心后与镍柱亲和，分别取样进行SDS-PAGE电泳。LAP各截短片段预期大小分别为LAP-A(18.78 kd)、LAP-A1(10.88 kd)、LAP-A2(14.94 kd)、LAP-A4(12.39 kd)、LAP-B(24 kd)、LAP-B2(10.32 kd)、LAP-C(17.39 kd)。结果表明，LAP-B有可溶表达，大小24 kd，与预期大小一致，其余截短LAP重组蛋白大多为包涵体表达，见图2。

图2 截短LAP重组蛋白小试SDS-PAGE检测结果注：M为Protein Marker；A、A1、A2、A4、B、B2、C为各个截短片段的LAP重组蛋白

2.3 LAP-B大量诱导表达及纯化LAP-B经IPTG低温诱导表达，发现重组蛋白以可溶形式存在，可进一步纯化。将LAP-B大量诱导表达，利用镍柱亲和纯化重组蛋白，洗脱目的蛋白。SDS-PAGE结果表明：经镍柱纯化成功得到高纯度的截短型LAP-B重组蛋白，见图3。

图3 a为LAP-B重组蛋白清洗杂蛋白SDS-PAGE图； b为LAP-B重组蛋白洗脱蛋白SDS-PAGE图注：M为protein marker；C为全菌；SN为上清；R15为清洗后的Ni-NTA beads；E为洗脱蛋白；ER为洗脱后的Ni-NTA beads

2.4 MTT检测TGF-β诱导HSC-T6细胞增殖结果不同浓度的LAP-B重组蛋白作用于TGF-β诱导的HSC-T6细胞72h测其OD490值，结果显示TGF-β活化组与对照组相比，其细胞活性升高；与模型组相比，2μg/mL、4μg/mL的LAP-B组对细胞增殖抑制的作用不明显(P>0.05)，细胞活性仍比较旺盛；8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL的LAP-B组对细胞增殖均有明显的抑制作用(P<0.05)，差异具有统计学意义，并且呈现剂量依赖性的趋势，表明LAP-B在2～64 μg/mL浓度范围内可以抑制TGF-β诱导的HSC-T6细胞增殖，见图4。

图4 MTT检测不同浓度LAP-B对TGF-β诱导HSC-T6细胞活性的影响注：与模型组比较，#P<0.05，###P<0.001

3 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤自我调节的方式，主要病理特征是ECM在肝内过量沉积。TGF-β是肝纤维化中上调胶原基因转录的重要成分[7]，刺激HSC的生成，从而促进肝纤维化的进展。TGF-β/Smad信号通路在肝纤维化发生发展中有重要调控作用，可以通过抑制TGF-β的生成，拮抗TGF-β受体，抑制Smads蛋白磷酸化以及调节相关基因表达调节纤维化相关疾病的发生与发展。有研究表明[8]通过腺病毒传递的转基因构成性表达TGF-β1反义mRNA可以阻断HSC的合成。另有研究表明[9]构建截短的胞内段TβRⅡ可竞争结合配体阻断TGF-β信号传递。TGF-β调节大量的细胞内信号级联来传递其促纤维化作用，通过调控Smad信号通路也可抑制HSC的增殖[10]。TGF-β最初被合成为前体蛋白，在酶的作用下形成LAP与TGF-β无生物活性的复合物。当复合物分泌到细胞外时，经过复杂的处理过程，LAP被解离出来，这时TGF-β才能发挥活性作用。因此LAP是TGF-β活化过程中重要的蛋白，本实验室前期通过构建不同截短片段的LAP，旨在与野生型的LAP竞争结合TGF-β，抑制TGF-β的活化[11]。

本实验通过小量试表达7个截短LAP重组蛋白，检测到LAP-B有可溶表达，其他大多为包涵体表达。石永萍等[11]通过包涵体的方式纯化出截短型LAP-B2，并发现该重组蛋白能够抑制HSC-T6细胞的增殖。考虑到包涵体表达需要胞外折叠，得率较低，且蛋白行为没有可溶表达的好[12]，因此本实验选择LAP-B可溶重组蛋白进行IPTG诱导表达。因重组蛋白的表达载体为PET28a，带His标签，因此选择镍柱亲和纯化。将LAP-B作用于HSC-T6细胞，发现在浓度为2～64 μg/mL范围内LAP-B对HSC-T6细胞没有毒性作用。因此选择该浓度范围的LAP-B作用于TGF-β诱导的HSC-T6细胞，检测其对HSC-T6细胞的增殖影响，发现在2～64 μg/mL范围内LAP-B显著抑制HSC-T6细胞的增殖，并随着剂量的增加，抑制该细胞增殖越显著。下一步拟做LAP-B重组蛋白对HSC-T6细胞的功能实验，为后续研究LAP重组多肽的抗肝纤维化作用提供新思路。