基于TGF-β1/p38MAPK通路探讨益气升清方对糖尿病大鼠肾组织的影响

江丹 汪何 姚楠

摘要 目的：探討益气升清方对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1/p38MAPK通路的影响。方法：SPF级大鼠60只，正常组10只，其余腹腔注射STZ制备DM模型。成模后随机分为模型组（等量蒸馏水）、厄贝沙坦组[27 mg/（kg·d）]、中药低剂量组[3.465 g/（kg·d）]、中药中剂量组[6.93 g/（kg·d）]、中药高剂量组[13.86 g/（kg·d）]，每组10只，给药8周，检测血糖、Scr、BUN，观察肾组织的病理，用荧光定量PCR和免疫组化法检测TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA和蛋白的表达。结果：造模后各组血糖较正常组有显著性升高（P<0.01），但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。模型组大鼠血清BUN、Scr显著增高（P<0.01），肾组织有大量TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表达（P<0.01）;与模型组比较，各观察组病理损害明显减轻，血清BUN、Scr明显降低（P<0.01），TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表达明显减少（P<0.01），厄贝沙坦组、中药中、高剂量组优于中药低剂量组（P<0.01）。结论：糖尿病大鼠TGF-β1/p38MAPK通路的激活导致肾间质病变，益气升清方可减少TGF-β1、p38MAPK的表达，从而减少FN的沉积，起到保护肾脏的作用。

关键词 益气升清方;糖尿病肾病;转化生长因子β/丝裂原活化蛋白激酶p38通路;纤维连接蛋白

Abstract Objective：To explore the effect of Yiqi Shengqing Fomula on TGF-β1/p38MAPK pathway in kidney tissue of diabetic rats. Methods：There were 60 SPF rats， among which 10 were in the normal group， and the rest were intraperitoneally injected with STZ to prepare DM models. After modeling， they were randomly divided into model group （equivalent distilled water）， irbesartan group [27 mg/（kg·d）]， low-dose Chinese medicine group [3.465 g/（kg·d）]， middle-dose Chinese medicine group [6.93 g/（kg·d）]， high-dose Chinese medicine group [13.86 g/（kg·d）]， 10 rats in each group. After 8 weeks of administration， blood glucose， Scr， BUN were detected， renal pathology was observed， quantitative fluorescence PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein. Results：After modeling， the blood glucose of each group was significantly higher than that of the normal group （P<0.01）， but there was no significant difference between the groups （P>0.05）. The serum BUN and Scr of rats in the model group were significantly increased （P<0.01）， and the kidney tissue had a large amount of TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein expression （P<0.01）; compared with the model group， the pathological damage of each treatment group was significantly reduced， Serum BUN and Scr were significantly reduced （P<0.01）， TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein expression were significantly reduced （P<0.01）， irbesartan group， middle and high-dose Chinese medicine group were better than low-dose Chinese medicine group （P<0.01）. Conclusion：The activation of TGF-β1/p38MAPK pathway in diabetic rats leads to renal interstitial lesion. Yiqi Shengqing Fomula can reduce the expression of TGF-β1 and p38MAPK， thereby reducing the deposition of FN and protecting the kidneys.

Keywords Yiqi Shengqing Fomula; Diabetic nephropathy; TGF-β1/p38MAPK signaling pathway; FN

中图分类号：R242;R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.006

糖尿病腎病（Diabetes Nephropathy，DN）是糖尿病严重的并发症，近年来研究发现尽管DN初期主要表现为肾小球病变所致的蛋白尿，但肾小管间质病变才是DN进行性发展过程中的始动因素，且比肾小球病变更能反映慢性肾功能衰竭的进展速率及预后[1]。转化生长因子β（Transform Growth Factor-β1，TGF-β1）/丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 Mitogen-activated Protein Kinase，p38MAPK）是肾脏纤维化过程中的重要信号通路。TGF-β1作为上游因子激活p38MAPK信号通路，MAPK活化增多与TGF-β1相互作用影响纤维连接蛋白（Fibro Nectin，FN）等细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的沉积;同时，活化的p38MAPK信号通路会诱导反向产物TGF-β1生成增多。所以阻断TGF-β1/p38MAPK信号通路对延缓DN病程进展具有重要意义[2]。

DN的中医病机目前认为在肾，但发病之根本在脾，又因患病日久易夹痰瘀，故本观察组汪何教授提出早期DN主要病机为脾气虚弱、清气下陷，夹痰瘀。治法为健脾益气、升清通络，自拟方益气升清方，前期大量临床观察已证实该方降低早期微量白蛋白、尿蛋白效果显著[3]。本研究旨在通过TGF-β1/p38MAPK通络探讨益气升清方对糖尿病大鼠肾的保护作用并探讨其机制，为DN的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量（200±20）g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：44007200027779。饲养于广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室[许可证号：SYXK（粤）2015-0059]，实验环境通风良好，温度21～24 ℃，湿度50% ～70%，12 h光照周期，自由摄水。实验前适应性喂养1周。本实验经过广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）实验动物伦理委员会审核通过（伦理审批号：048460）

1.1.2 药物 高糖高脂饲料（广东省医学实验动物中心提供，货号：44200300009327）;链脲佐菌素（Streptozocin STZ，Sigma公司，货号：S0130）;厄贝沙坦片[赛诺菲（杭州）制药有限公司，国药准字H20040494];自拟益气升清方汤药（由黄芪、红参、柴胡、葛根、丹参等饮片组成，按照动物实验中药制作标准煎煮浓缩而成），均以蒸馏水按比例配置成所需浓度，4 ℃冰箱保存。

1.1.3 试剂与仪器 实验试剂：葡萄糖试剂（南京建成生物工程研究所，货号：A031-1），Scr试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：C011-1），BUN试剂（南京建成生物工程研究所，货号：C013-2）。一抗兔抗鼠p38MAPKRabbit ab试剂（Cell Signaling Technology，美国，货号：9212S），一抗兔抗鼠Anti-Fibronectin antibody[艾博抗（上海）贸易有限公司，货号：ab2413]，一抗兔抗鼠Anti-TGF beta 1 antibody[艾博抗（上海）贸易有限公司，货号：ab92486]。二抗免疫组化试剂UItraSensitive S-P超敏试剂盒（鼠/兔）（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：40398a）。DAB显色液（福州迈新生物技术开发有限公司，货号：DAB-0031）;基因引物（上海英潍捷基贸易有限公司合成）。

实验仪器：722光栅分光光度计（上海安亭科学仪器厂，型号：722型），小型高速离心机（Eppendorf公司，德国，型号：5424型），切片机（莱卡公司，德国，型号：LEICA RM2O15型），数码生物显微镜（重庆奥体光学显微镜有限公司，型号：BK-DM500型），MIAS医学图像分析管理系统（北京航空航天工业大学），超级纯水仪（默克密理博有限公司，美国，型号：Milli Q Plus型），核酸蛋白测定仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司，美国，SmartSpec plus型]，荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国，IQTM5型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按随机数字表取10只大鼠作为正常组，给予普通饲料。其余50只大鼠高糖高脂饲料喂养，禁食不禁水12 h，单次腹腔注射STZ 35 mg/kg，72 h后尾尖采血，血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。正常组10只大鼠腹腔注射相应容量枸椽酸缓冲液。将造模成功的糖尿病大鼠随机分为5组：模型组、厄贝沙坦组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组，每组10只，高糖高脂饲料喂养。

1.2.2 给药方法 中药低、中、高剂量组给药量分别为3.465 g/（kg·d）（1/2临床剂量）、6.93 g/（kg·d）（临床等效剂量）、13.86 g/（kg·d）（2倍临床剂量）;厄贝沙坦组用27 mg/（kg·d）剂量灌胃;模型组及正常组给予等剂量双蒸水灌胃。1次/d，连续8周。

1.2.3 检测指标与方法 处死大鼠，将右侧肾去包膜保存于10%中性甲醛固定液中，常规石蜡包埋，切片;另一侧肾脏液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存。实验过程中模型组、中药低剂量组分别死亡1只大鼠，实验结束大鼠共58只。造模成型后尾尖采血测葡萄糖，8周实验结束前主动脉采血测葡萄糖、肌酐（Serum Creatinine，Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）。荧光定量PCR法测定TGF-β1、P38MAPK、FN基因表达量。引物序列：TGF-β1，F：GGAGACGGAATACAG，R：ATGAGGAGCAGGAA，152bp;p38MAPK，F：CTCGCTGTGAATGA，R：TGTCTGGTTGTAGTG，144 bp;FN，F：GGCAGTAGCACAGA，R：TCCACAGCATAGATAGT，101 bp。应用RNAprep pure组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。按照反转录说明书合成cDNA，由PCR反应曲线得到Ct值，计算相对定量结果。

取固定后的石蜡切片，HE染色;同时用免疫组化试剂盒检测肾组织TGF-β1、p38MAPK、FN蛋白表达。用MIAS医学图像分析管理系统进行图像采集，读片时每张片子取5个区域拍照，应用IPP 6.0病理图像分析软件随机测定免疫阳性产物的光密度值（OD值），然后作为该样本的OD值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数值采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用one-way ANOVA检验，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

造模后各组血糖升高与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01），但造模后各组之间血糖比较差异无统计学意义（P>0.05），且治疗8周后各组血糖变化比较差异无统计学意义（P>0.05），表明造模后各组大鼠一直处于高血糖状态，模型成功。与模型组比较，厄贝沙坦组，中药低、中、高剂量组Scr、BUN均有下降，且比较差异有统计学意义（P<0.01），厄贝沙坦组、中药中、高剂量组BUN下降优于中药低剂量组（P<0.01）。结果见表1。

模型组大鼠肾组织TGF-β1、p38MAPK和FN基因表达量与正常组比较显著增多（P<0.01）。与模型组比较，厄贝沙坦组，中药低、中、高剂量组大鼠肾组织TGF-β1、p38MAPK、FN基因表达量均显著减少（P<0.01）。与厄贝沙坦组比较，中药中、高剂量组TGF-β1、FN基因表达量比较差异无统计学意义（P>0.05），中药低剂量组TGF-β1、FN基因表达量多于厄贝沙坦组（P<0.01）;中药低、中剂量组p38MAPK基因表达量多于厄贝沙坦组（P<0.01），中药高剂量组p38MAPK基因表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

光镜下HE染色结果显示：正常组肾单位饱满无间隙，肾小球内散在少部分红细胞，肾小管细胞丰富，排列规则。模型组肾小球分叶状，体积缩小，部分肾小球上皮细胞增生，囊腔间隙变大，大量红细胞沉积;肾小管空泡样变，部分管壁变薄，管腔变大。厄贝沙坦组肾小球内红细胞数目减少，肾小球管腔变化不明显。中药低剂量组肾小球囊腔间隙稍增大;肾小管扩张，空泡样变;髓質间质有部分充血。中药中剂量组肾小球内红细胞数目减少，囊腔间隙稍增大，无分叶状改变;肾小管空泡样变较少，有散在红细胞。中药高剂量组较中剂量组肾小管空泡样变更少。结果见图1。

免疫组化结果显示，正常组大鼠肾组织TGF-β1、FN蛋白在部分肾小球、肾小管有少量表达（棕黄色颗粒，以下同）;p38MAPK在部分肾小管有少量表达。模型组大鼠肾组织TGF-β1、p38MAPK和FN较正常组明显增多，以肾小管表达为主，肾小球也有明显表达。与模型组比较，厄贝沙坦组，中药中、高剂量组大鼠肾小管TGF-β1、p38MAPK和FN蛋白表达量明显减少，且减少程度相当;中药低剂量组大鼠TGF-β1、p38MAPK和FN蛋白表达也有一定程度减少。结果见图2。

各组平均光密度值结果如下：模型组TGF-β1、p38MAPK和FN表达量均较正常组显著增多（P<0.01）。与模型组比较，中药低剂量组TGF-β1、p38MAPK表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，厄贝沙坦组和中药中、高剂量组TGF-β1表达量均显著减少（P<0.01）;中药中剂量组p38MAPK表达量达略高于厄贝沙坦组、中药高剂量组（P<0.01），但3组间TGF-β1表达量比较差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组比较，厄贝沙坦组，中药低、中、高剂量组FN表达量均显著减少（P<0.01）;中药低剂量组FN表达量高于厄贝沙坦组（P<0.01）;中药中、高剂量组FN表达量与厄贝沙坦组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表3。

3 讨论

益气升清方是广东省名中医汪何教授的临床经验方，针对早期DN多无症状，仅有倦怠乏力，小便夹杂泡沫，或便溏，舌淡苔薄，脉象软的症状。目前多数学者主张DN的主要病机是脾肾亏虚为本，血瘀所致微型癥瘕为标[4]。汪何教授认为早期DN的主要病机是脾气虚弱、清气下陷，兼夹痰瘀，故提出健脾益气、升清通络为治法。以黄芪为君，一可补气健脾以治气虚之本，二可升提下陷阳气，以求浊降清升，水谷精气生化有源;葛根为臣药，具有益气生津之效;柴胡、丹参为佐，柴胡佐助升举清阳，丹参有活血化瘀之力;红参为使，旨在纠正气虚，补太阴之生气，使“阳得阴助而生化无穷”。组方既切合早期DN的主要病机，又可照顾兼夹症，达到标本兼治目的[5]。团队前期大鼠实验研究发现该方可以抑制DN大鼠肾组织Notch1、Jagged1的高表达，减少TGF-β1的表达，从而减少大鼠24 h尿微量白蛋白排泄，起到保护肾脏的作用[6]。

DN病理改变传统被认为是肾小球疾病，早期主要表现为肾小球和肾小管的肥大，基本病理改变最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。因此，肾小管间质纤维化也是糖尿病患者不可逆性的肾脏改变。TGF-β1是临床慢性肾病进展的重要生物学标志物和治疗靶标，参与DN的进程。研究表明TGF-β1/p38MAPK信号通路与肾脏炎性反应及纤维化密切相关，由于表皮生长因子、胰岛素样生长因子促分裂与TGF-β的促分化作用对肾小管上皮细胞内蛋白水解的抑制刺激反复存在，导致上皮细胞的过度、异常增殖与肥大，促进了肾间质的炎性反应与纤维化的形成。p38MAPK可以诱导炎性反应细胞的活化和增殖。TGF-β1在信号通路的上游，通过激发p38MAPK而发挥其生物活性;同时，TGF-β1而作为下游p38MAPK信号通路的产物，合成增多可加剧肾小球硬化和肾间质纤维化，加速慢性肾脏病进展[7]。FN有促进巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞与纤维基质间连接的生理作用。在DN时与Ⅳ型胶原一起作为ECM的主要成分而沉积增多。研究显示短时间的高糖刺激亦能使肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路激活，抑制p38MAPK信号通路可减少FN的表达[8]。

本实验结果显示，造模后各组血糖较正常组有显著性升高（P<0.01），但造模后各组之间血糖比较差异无统计学意义（P>0.05），且治疗8周后各组血糖变化比较差异无统计学意义（P>0.05），表明造模后各组大鼠一直处于高血糖状态，模型成功。模型组大鼠血清BUN、Scr显著增高（P<0.01）;肾组织有大量TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表达（P<0.01），说明DN大鼠肾功能受损，肾小管间质中阳性p38MAPK细胞数量反应了间质损伤程度。血管紧张素Ⅱ作为RAS主要的生物活性肽，不仅可以改变肾小球血流动力学，促进肾小球系膜细胞增生肥大，还可激活p38MAPK信号通路，能够提高下游炎性反应信号通路的激活水平，导致炎性反应因子如肿瘤坏死因子α水平的上升，提高肾脏炎性反应性损伤的程度，最终导致ECM过度沉积[9]。厄贝沙坦是RAS受体抑制剂，能够阻断RAS降低蛋白尿和抑制肾小球的硬化，延缓DN的進展，具有肯定的肾脏保护作用，因此作为阳性对照药物。与模型组比较，各观察组肾脏病理损害明显减轻，血清BUN、Scr明显降低（P<0.01），TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表达明显减少（P<0.01），厄贝沙坦组、中药中、高剂量组优于中药低剂量组（P<0.01）。说明自拟方存在着一定的量效关系，中药中剂量组（临床等效剂量）具有明显的疗效，且中药高剂量组优于中剂量组。组方中药现代药理学结果显示：黄芪中的黄芪多糖[10]、葛根中的葛根素[11]能抑制糖尿病大鼠肾组织TGF-β1mRNA的过度表达，丹参中的丹参酮可抑制成纤维细胞增殖和表型转化，减少胶原沉积，抑制NO产生及释放[12]，改善糖尿病大鼠早期肾脏病理改变。

综上所述，益气升清方能够减轻肾脏损害，改善肾功能，其作用机制可能是通过调控TGF-β1/p38MAPK信号转导通路，减少FN的沉积，起到明显的糖尿病肾脏保护及延缓病程进展的作用。

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（2019-11-24收稿 责任编辑：徐颖）