归芪活血胶囊对颈椎病模型大鼠软骨细胞的影响

程国良 姜艳玲 李冰冰

摘要 目的：研究归芪活血胶囊对颈椎病模型大鼠软骨细胞白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）及MKK3/6-p38MAPK信号通路的影响。方法：选取60只SD级大鼠作为研究对象，将其以随机抽签法等分成假手术组、模型组、归芪活血胶囊组。其中模型组与归芪活血胶囊组参考颈椎间盘退变模型，假手术组仅切开皮肤，随后缝合。模型组不予以任何干预，归芪活血胶囊组则予以归芪活血胶囊灌胃治疗。干预4周后，通过甲苯胺蓝实施组织染色，以免疫组织化学法检测软骨细胞IL-6、IL-8含量，同时以Weatern Blot法检测MKK3/6以及p38MAPK表达水平。结果：假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞IL-6水平、IL-8水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞MKK3/6水平、p38MAPK水平相较于模型组明显更低（均P<0.05）。经Pearson相关性分析可得：颈椎病模型大鼠软骨组织IL-6、IL-8水平與MKK3/6、p38MAPK表达水平比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论：归芪活血胶囊的应用可显著降低颈椎病模型大鼠软骨细胞IL-6、IL-8含量，同时可下调软骨细胞MKK3/6以及p38MAPK蛋白表达水平，其主要机制可能是通过调节MKK3/6-p38MAPK信号通路，进一步下调IL-6、IL-8含量，从而达到治疗颈椎病的目的。

关键词 颈椎病;归芪活血胶囊;白细胞介素-6;白细胞介素-8;MKK3/6-p38MAPK信号通路

Abstract Objective：To study the effects of Guiqi Huoxue Capsule on interleukin-6（IL-6），interleukin-8（IL-8）and mkk3/6-p38mapk signaling pathway in cervical spondylosis model rats.Methods：A total of 60 SD rats were selected as the research objects，and they were randomly divided into a sham operation group，a model group and a Guiqi huoxue Capsule group.The model group and the Guiqi Huoxue Capsule group referred to the cervical disc degeneration model，while the sham operation group only cut the skin and sutured it afterwards.The model group was not given any intervention，while the Guiqi huoxue Capsule group was given gavage to the treatment group.After 4 weeks of intervention，tissues were stained with toluidine blue，and IL-6 and IL-8 contents in chondrocytes were detected by immunohistochemistry，and mkk3/6 and p38MAPK expression levels were detected by Weatern Blot.Results：The IL-6 levels of cervical intervertebral disc chondrocytes in the sham operation group and the Guiqi Huoxue Capsule group were which were significantly lower than those in the model group，with significant differences（P<0.05）.The levels of MKK3/6 and p38MAPK of chondrocytes in cervical intervertebral discs of rats in the sham operation group and Guiqi Huoxue Capsule group were significantly lower than those in the model group（both P<0.05）.Pearson correlation analysis showed that the levels of IL-6 and IL-8 in cartilage tissue of cervical spondylosis model rats were significantly different from the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK（all P<0.05）.Conclusion：The application of Guiqi Huoxue Capsule can significantly reduce the contents of IL-6 and IL-8 in chondrocytes of cervical spondylosis model rats，and down-regulate the expression levels of MKK3/6 and p38MAPK protein in chondrocytes.The main mechanism may be to further down-regulate the contents of IL-6 and IL-8 by regulating the MKK3/6-p38mapk signaling pathway，so as to achieve the purpose of treating cervical spondylosis.

Keywords Cervical spondylosis; Guiqi huoxue Capsule; Interleukin-6; Interleukin-8; Mkk3/6-p38MAPK signaling pathway

中图分类号：R681.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.003

随着人们生活方式以及工作形式的不断改变，颈椎病的发病率正呈逐年升高趋势，椎间盘退变是颈椎病主要的病理基础，且会累及周围软组织、脊髓神经根以及血管[1]。有相关研究报道显示，炎性细胞因子参与了椎间盘退变过程，其主要机制可能与软骨终板破坏有关[2]。另有相关研究报道表明，在椎间盘退变后，对患者众多炎性细胞因子水平进行检测发现[3]，白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）分泌呈增多现象。因此积极减少炎性反应细胞因子的产生，早期对软骨细胞的炎性反应进行有效抑制，延缓炎性细胞因子导致的软骨终板退变，对椎间盘突变的防治具有极其重要的意义，应予以重视。目前临床上治疗颈椎病包括手术治疗以及保守治疗，前者本身存在一定的风险性，且术后易出现一系列并发症，不利于推广普及。后者相较于前者而言，更易被患者所接纳，尤其是中草药治疗具有不良反应少、经济成本低、舒适性较高以及操作简便等优势[4]。鉴于此，本文通过研究归芪活血胶囊导致颈椎病模型大鼠软骨细胞IL-6、IL-8及MKK3/6-p38MAPK信号通路的变化，旨在为归芪活血胶囊应用于颈椎病的治疗中提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取60只SD级大鼠作为研究对象，大鼠均购自南京青龙山动物实验中心，均为清洁级，体质量为230～270 g，均实施单笼饲养，自由饮水，控制室温在24 ℃左右。

1.1.2 药物 归芪活血胶囊（鲁南厚普制药有限公司，国药准字Z20090686），药物主要成分：黄芪、当归、白芍、制何首乌、枸杞子、槲寄生、鹿茸、骨碎补、威灵仙、透骨草、人工麝香、葛根、川芎等。

1.1.3 试剂与仪器光学显微镜（上海普赫光电公司，Pooher型）;RM2235切片机（莱卡公司，德国，型号：RM2235型）;石蜡包埋机（亚光医用公司，型号：YB-9LF）;FlexiFprce ELF System（Tekscan公司，美国，型号：FlexiFprce ELF）;超低温冰箱（SANYO公司，日本，型号：MDF-C8V）;低温高速离心机（Beckman公司，美国，型号：Microfuge22R）;Images Advanced 6.0医学图像采集系统（麦克奥迪公司，加拿大，型号：Motic Med6.0）;10%水合氯醛、无水乙醇、枸橼酸缓冲液、苏木精染液、冰醋酸、甲苯胺蓝、丽春红染色液（Bellman.TECH公司，美国，货号：150245、163473、119248、102433、141681、162059、138230）;磷酸盐缓冲液（Hyclone公司，美国，货号：018023）;PVDF膜（Millipore公司，美国，货号：019004）;IL-6、IL-8免疫组化SP试剂盒（BIO-RAD公司，美国，批号：018244、018631）;免疫印迹一抗（CST公司，美國，货号：019102）;BCA蛋白定量盒、RIPA裂解液、二抗、TBS以及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（Beyotim TECH公司，美国，货号：020144、017348、019409、020102、018317）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将上述60只SD级大鼠以随机抽签法分成假手术组、模型组、归芪活血胶囊组，每组20只。首先对大鼠进行称重，严格按照体质量予以腹腔注射麻醉药，确保大鼠充分麻醉。将麻醉后的大鼠固定于固定板上，要求大鼠的腹部和固定板紧贴，四肢粉笔固定在两侧，背部朝上。对其颈后部位的毛发进行剪除处理，通过碘伏消毒后，以手术刀在大鼠颈背部后正中线位置纵向切开皮肤，切口长度2.5 cm。假手术组大鼠手术切开后即常规止血缝合。模型组和归芪活血胶囊组借助血管钳等器材，逐层钝性分离肌肉，切断颈部浅层与深层肌肉组织。术后予以常规止血、缝合处理，观察组大鼠情况，并继续饲养3个月。

1.2.2 给药方法 假手术组大鼠每日定点予以固定处理，但不予以其他手段干预。模型组大鼠造模成功后不予以任何干预。归芪活血胶囊组大鼠在造模成功后实施归芪活血胶囊灌胃干预，使用剂量为1粒/次，3次/d，连续干预4周。

1.2.3 标本采集 分别称重大鼠，予以致死量腹腔麻醉，确定大鼠麻醉到位后，于低温条件下进行相关实验操作。保留大鼠枢椎，实施枕骨后的断头处理。用手术刀顺着大鼠颈后部正中线纵向切开皮肤，钝性分离各层肌肉和软组织，取下C2～7颈椎骨，手术过程中务必保证椎间盘以及软骨完整性。采用PBS液体清洗干净取下的组织，用4%多聚甲醛将部分椎间盘组织固定1～2 d，用于免疫组化检测。剩下的组织用液氮保温瓶冷冻，并尽快置于-80 ℃冰箱保存，用于Western Blot检测。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 采用免疫组织化学法检测检测IL-6、IL-8的含量 具体方法：对石蜡标本进行切片、脱蜡、水化处理，以超纯水反复冲洗，并以PBS液重复冲洗3次，3 min/次。予以抗原修复、染色以及观察。

1.3.2 采用Western Blot检测MKK3/6、p38MAPK表达水平 具体方法：首先将组织用液氮冷冻，然后称重并迅速放入匀浆器皿内，加入定量的液氮研磨组织至粉末为止。滴加60 μL/mg预冷含PMSF的蛋白裂解液，确保椎间盘组织充分裂解。重复碾磨组织，反复数次，间隔2 min/次。然后将研磨组织放置于冰上裂解30 min，在蛋白被充分裂解后，将裂解完成的组织置入做好标记的离心管内于4 ℃温度下离心，离心条件为1 200 r/min，时长5 min，取上清液，分装于EP管内，保存在-80 ℃冰箱中。取96孔板分别加入相应试剂，振荡30 s后，放置在37 ℃恒温箱中孵育0.5 h，进行比色测定。然后进行SDS-PAGE电泳、转模处理，并依次加入一抗、二抗，显影后进行图像分析。通过成像分析仪进行测定，并以目标带与Graph条带灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用t检验;计数资料用百分比（%）表示，采用χ2检验。颈椎病模型大鼠软骨组织IL-6、IL-8水平与MKK3/6、p38MAPK表达水平的关系采用Pearson相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 3组大鼠颈椎间盘软骨细胞IL-6、IL-8水平比较 假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞IL-6及IL-8水平均显著低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3.2 3组大鼠颈椎间盘软骨细胞MKK3/6以及p38MAPK表达水平比较 假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞MKK3/6及p38MAPK水平相较于模型组均明显更低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3.3 颈椎病模型大鼠软骨组织IL-6、IL-8水平与MKK3/6、p38MAPK表达水平的相关性分析 经Pearson相关性分析，颈椎病模型大鼠软骨组织IL-6、IL-8水平与MKK3/6、p38MAPK表达水平均呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

4 讨论

中医学认为，颈椎病当属“眩晕”“痹症”范畴，其主要发病机制为肝肾内窥，其标为风、寒、湿痹着，病位于筋骨[5-7]。中医对颈椎病症候诊断标准囊括下述4个类型：气滞血瘀证：受外伤或（和）损伤导致颈椎病证，其表现为痛点固定，多见夜间加重，伴有肢体麻木，舌紫暗，脉涩等。风寒阻络证：由风寒湿邪导致的颈椎病证，表现为颈项疼痛、活动不利、肢端麻木舌淡苔薄脉沉迟等症状。肝阳上亢证：表现为颈部疼痛麻木不适，伴头痛目赤，急躁易怒，便秘，舌红苔黄，脉弦等症状[8-10]。气血不足证：由气血不足导致的病证，表现为胀痛沉重，伴眩晕膝软，无力疲惫，舌淡苔白脉无力等。归芪活血胶囊具有益气补肾、活血通路的作用，可治疗因身体虚弱、烦劳、经常伏案工作以及外伤、先天畸形等因素导致的颈椎病[11-13]，然而关于其具体作用机制尚且进一步从细胞、分子生物水平上进行研究。

IL-6和椎间盘基质降解酶存在密切相关，IL-6可能正是通过酶的活性被抑制途径发挥的致炎作用，其中IL-6可影响其他致炎物质的释放，且在局部炎性反应过程中，IL-6可增强局部反应[14-15]，因此IL-6可能会促进椎间盘退变的进程。IL-8作为炎性反应促进因子之一，其可在炎性反应细胞聚集过程发挥进行性刺激作用，同时可激活以及促进炎性反应递质的释放，进一步加速了椎间盘中的炎性反应，促进了病情进展[16-17]。本文结果发现，假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞IL-6、IL-8水平均显著低于模型组（均P<0.05）。这在杜伟等人的研究中得到证实[18]：IL-6具有促炎以及抗炎的双作用，可在一定程度上影响椎间盘退变，且表达水平和椎间盘退变呈正相关趋势。同时董振风等人采用放免法测量IL-8以及TNF的作用机制发现[19]：在椎间盘退变中，于突变早期阶段上述2种炎性因子的含量较低，而随着突出程度的加剧，其含量显著增加。分析原因，笔者认为IL-6可通过刺激炎性反应细胞的聚集，促进炎性反应递质合成，进一步介导了椎间盘退变的过程。而IL-8可大量合成MMP-3，继而引起巨噬细胞大量的聚集，加速了椎间盘退变的吸收过程，并加重了椎间盘退变的炎性反应。因此作者推测，归芪活血胶囊治疗颈椎病的可能机制在于下调IL-6与IL-8的表达。此外在椎间盘退变过程中，突变程度的加剧和磷酸化情况均与p38MAPK信号通路存在密切相关，激活的p38MAPK信号通路会促进炎性细胞因子的大量聚集，进一步通过促进细胞外MMPs释放等途径，促进了椎间盘退变进程[16]。另外p38MAPK的级联反应分别为MKK3/6、P38MAPK、PAK、MLK，其中PAK、MLK的磷酸化会促进MKK3/6的表达，进一步诱导p38MAPK基因转录。而本文结果发现，假手术组、归芪活血胶囊组大鼠颈椎间盘软骨细胞MKK3/6、p38MAPK水平相较于模型组明显更低（均P<0.05）。这提示了归芪活血胶囊用于颈椎病大鼠治疗中的可能机制为影响MKK3/6-p38MAPK信号通路。

综上所述，归芪活血胶囊的应用可抑制MKK3/6-p38MAPK信号通路，继而抑制IL-6、IL-8的表达，最终达到防治椎间盘退变的目的。

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（2020-05-15收稿 责任编辑：王杨）