松花粉总黄酮对小鼠化学性肝损伤保护效应探析

黄爱招 李亦聪 梁超峰

摘要 目的：觀察松花粉总黄酮对急性化学性肝损伤模型小鼠的作用机制。方法：60只ICR小鼠随机分为空白组、模型组及实验组，每组20只。其中模型组及实验组制备小鼠急性肝损伤模型，模型制备成功后实验组每日灌胃松花粉总黄酮，空白组及模型组灌胃同等剂量的生理盐水，连续干预10 d。比较3组肝脏病理变化，外周血谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的活性以及PI3K-AKT信号通路标志性蛋白水平变化。结果：1）空白组小鼠肝脏形态正常，模型组小鼠肝脏出现明显病理改变，实验组小鼠肝脏细胞空泡及炎性反应侵润现象较模型组减轻，肝脏细胞轻微坏死。2）与空白组比较，模型组外周血ALT、AST及Bax浓度均明显上调（P<0.05），Bcl-2表达下降（P<0.05）;实验组上述指标明显改善。3）模型组肝脏组织的PI3K、p-AKT水平明显下降，干预后小鼠上述指标表达明显上调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：松花粉总黄酮对化学性肝损伤有保护效应，其作用机制可能与介导PI3K-AKT信号通路有关。

关键词 化学性肝损伤模型，小鼠;松花粉总黄酮;ALT;AST;PI3K-AKT

Abstract Objective：To observe the mechanism of total flavonoids of pine pollen on acute chemical liver injury model mice. Methods：A total of 60 Institute of Cancer Research（ ICR） mice were randomly divided into blank group （n=20）， model group （n=20） and experimental group （n=20）. The mouse model of acute liver injury was made in the model group and the experimental group. After the successful preparation of the model， the experimental group was intragastrically infused with total flavonoids of pine pollen every day， and the blank group and the model group were intragastrically infused with the same dose of normal saline for 10 days. The pathological changes of liver， the activities of glutamic pyruvic transaminase （ALT） and glutamic oxaloacetic transaminase （AST） in peripheral blood and the levels of marker proteins in PI3K-AKT signal pathway were compared among the three groups. Results：1） the liver morphology of mice in the blank group was normal， and there were obvious pathological changes in the model group. The vacuolation and inflammatory infiltration of liver cells in the experimental group were less than those in the model group， and the liver cells were slightly necrotic. 2） compared with the blank group， the concentrations of ALT， AST and Bax in the model group were significantly increased， and the expression of Bcl-2 was decreased in the model group， and the above-mentioned indexes were significantly improved in the experimental group. 3） the levels of PI3K and p-AKT in the liver tissue of the model group decreased significantly， and the expression of the above-mentioned indexes increased significantly after intervention in the experimental group， which was significantly different from that of the model group （P<0. 05）. Conclusion：Total flavonoids of pine pollen have protective effect on chemical liver injury， and its mechanism may be related to the mediation of PI3K-AKT signal pathway.

Keywords Chemical liver injury model; Mouse; Total flavonoids from pine pollen; ALT;AST;PI3K-AKT

中图分类号：R285.5 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.004

肝炎可引起肝细胞凋亡，诱发肝功能的下降、导致肝硬化和肝癌[1]。为了调节肝脏内过量的炎性反应，往往会使用大量的抑制免疫系统的甾体类药物，以及一些抗氧化剂来弥补肝损伤。但是，这些免疫抑制剂具有肾功能降低及机会感染等不良反应[2]。随着研究的逐渐深入，越来越多文献支持肝臟细胞增殖/凋亡失常是急性化学性肝损伤发生发展的关键，PI3K-AKT信号通路是经典的与细胞增殖/凋亡密切相关的分子信号通路，有研究[3]显示急性化学性肝损伤程度与PI3K/AKT信号通路激活程度密切相关。

松花粉是我国传统食药兼用的花粉品种，神农本草、本草纲目等多种医籍中均有记载，有润心肺、益气、祛风止血的功能[4-5]。松花粉中的多种酶、核酸、有机酸、黄酮等生物活性物质能调节人体功能，具有延缓衰老，促进新陈代谢的功能，对于保健及功能药物的开发具有重要意义。本团队研究显示松花粉可明显改善患者肝功能，但其作用机制不明，因此我们以ICR小鼠为研究对象，以期探讨松花粉总黄酮的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SPF级昆明种雄性ICR小鼠，体质量为20～24 g，适应期间自由摄食与饮水。所有动物饲养于本院动物实验中心，饲养条件：温度（22±1.5）℃，湿度（50±2.）%，以12/12 h为光暗周期。各组小鼠在体质量、鼠龄各方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究方案经医院伦理会审批通过（伦理审批号：392034-5）。

1.1.2 药物 松花粉黄总酮由本院药剂科从马尾松花粉提炼而成，本研究马尾松花粉购自福贞堂[（长春）参茸有限公司，货号：392832]。马尾松花粉经超微粉碎，石油醚回流脱脂、乙醇回流浸提后洗脱、挥干而得。

1.1.3 试剂和仪器 PI3k一抗抗体（Abcam公司，美国，货号：ab19897）;AKT一抗抗体（Abcam公司，美国，货号：ab151796）;p-AKT一抗抗体（Abcam公司，美国，货号：ab129182）;Model68酶标仪（Bio-Rad Laboratories公司，美国，型号：M-68）;SDS配胶试剂盒（碧云天生物公司，货号：3923）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 60只小鼠数字随机法分为空白组（20只）、模型组（40只），参考文献[6]中急性化学性肝损伤小鼠模型制备方法，给予1次性腹腔注射0.1%的CCl4-豆油溶液10 mL/kg，使之形成急性的肝脏损伤后的动物模型组。将空白组中小鼠的腹腔中注射进入同等量的生理盐水溶液。

1.2.2 给药方法 实验组用5 mL/kg松花总酮灌胃，空白组及造模组大鼠接受等体积生理盐水灌胃，各组均连续干预10 d。

1.2.3 检测指标及方法

1.2.3.1 HE染色观察肝脏病理结构改变 各组干预结束后将小鼠充分麻醉后冰上快速取出肝脏组织置于多聚甲醛溶液内，随后进行脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡，再将标本置于苏木精水溶液中染色数分钟，再进行脱水透明，将已透明的切片用树胶封固后光镜下观察肝脏组织病理变化。

1.2.3.2 Western Blot检测各组小鼠肝脏组织PI3K、p-AKT水平变化 干预结束后各组随机抓取5只小鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出肝脏组织，按照100 mg：0.5 mL裂解液的比例加入适量1%PMSF的蛋白裂解液，匀浆后室温下静置10 min后，用BCA试剂盒测定样本总蛋白，根据结果得出上样量后进行电泳跑胶，转膜，加入PI3K、p-AKT及β-actin一抗，比例均按照1∶ 1 000稀释，再进行生物辣根过氧化酶HRP标记的二抗孵育，最后显影、拍摄，用Image（BIO-RAD公司）的图像处理软件进行处理，测定各样本灰度值。

1.2.3.3 ALT、AST、Bcl-2、Bax浓度检测 收集大鼠的腹主动脉血，4 ℃ 10 000 r/min下离心5 min，离心半径15 cm，抽吸上清液，使用ELISA（酶联免疫吸附试验）对小鼠外周血清ALT、AST、Bcl-2、Bax浓度进行检测，具体过程如下：将样本滴加如反应孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗涤反应孔后每孔加入0.1 mL的酶标抗体，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗涤，随后在各反应孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 M硫酸0.05 mL中止反应。随后将反应孔板置于酶标仪中读取数据，波长设置492 nm。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。所得数据都用（均数±标准差）（±s）来描述，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验;组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肝脏组织HE染色结果 空白组小鼠的肝脏表面光滑，色泽均匀，颜色鲜红，肝脏细胞排列有序。模型组小鼠肝脏组织质地较硬，肝脏边缘粗糙，颜色暗沉无光泽，肝脏细胞坏死，空泡及炎性反应侵润现象明显，表面见散在的点状及片状出血点;实验组小鼠肝脏细胞空泡及炎性反应侵润现象较模型组减轻，肝脏细胞轻微坏死。见图1。

2.2 各组肝脏组织PI3K、p-AKT水平变化 经过模型制备的小鼠肝脏组织的PI3K、p-AKT水平明显下降，经过松花粉总黄酮干预后小鼠上述指标表达明显上调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。具体见图2，表1。

2.3 各组外周血ALT、AST、Bax及Bcl-2活性比较  与空白组比较，接受急性化学性肝损伤模型制备的小鼠外周血ALT、AST及Bax浓度均明显上调（P<0.05），Bcl-2表达下降（P<0.05）;与模型组比较，实验组小鼠ALT、AST及Bax浓度有所下降，Bcl-2表达增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

化学性肝损害指的是各种因素（大量乙醇摄入、药物、有毒物质等）对肝脏组织产生损伤性破坏的一类疾病。急性化学性肝损害治疗不及时或不当，会进而发展成肝硬化、肝癌[7-9]。近年来由于环境污染日趋严重、药物滥用或生活方式改变，急性化学性肝损伤发病率逐年升高，故急性化学性肝损伤早期发现、及时有效干预，是抑制其发展成重症不可逆转肝病的关键。CCL4所致的肝损害模型是目前经典的肝损伤模型，该模型重现性强，且可准确反映出肝细胞损害的物理形态学变化，大量的国内外文献均以该模型为研究媒介进行一系列研究，故本研究亦采用CCL4所致的肝损害模型小鼠作为研究对象。松花粉首载于《唐本草》，入肝脾两经[10-11]。《本草经解》中认为：“松花，气温益肝之阳气，味甘益脾之阴气也……风气通肝，气温散肝”，是治疗肝脏疾病的药食兼用花粉品种。大量的临床文献亦证实松花粉或者其主要成分松花粉总黄酮可有效治疗肝脏疾病。本研究利用CCL4所致的肝损害模型小鼠作为研究对象，证实了松花粉总黄酮确可有效降低模型鼠ALT及AST水平，这意味着松花粉总黄酮确有明显的保肝效应。ALT及AST是诊断肝功能损伤的主要指标，然而在临床中ALT及AST的轻度升高并不足以引起临床工作者的重视，这就意味着早期化学性肝损伤极易被忽略，从而为疾病的进一步恶化留下隐患，因此在ALT及AST基础上探寻敏感的生物标志物，是更准确的预测化学性肝损伤的关键。

既往传统认为肝脏细胞的异常凋亡是肝脏化学行损伤主要形式，但随着研究的不断深入，越来越多证据显示细胞凋亡参与了肝脏缺血的病理变化过程[12-13]。肝脏细胞的缺血缺氧导致了细胞凋亡效应增强，而肝脏异常凋亡是导致肝功能受损的重要原因，此外，肝脏细胞属于可执行特定功能的终末分化成熟细胞，再分裂潜能极其微弱，故肝脏坏死导致的细胞减少或丢失对肝功能具有致命的影响，而细胞凋亡在一定程度属于部分可逆，因此抗凋亡是治疗肝损伤，改善其远期预后的重要靶向。PI3K/AKT信号通路是经典抗凋亡通路，PI3K激活后介导第二信使PIP3的生成，PIP3进一步结合下游的AKT使其核移位，促进AKT的磷酸化而影响其构象的改变，启动细胞凋亡程序[14-15]。Bcl-2与Bax亦是与凋亡密切相关的因子，两者之间有45%的同源性，作用相反，当Bcl-2与Bax形成异二聚体复合物后相互抑制功能，有研究人员[16-18]证实正常生理状态下Bax以单体的形式存在于细胞核内，在受到凋亡信号的刺激后其构象发生变化，寡聚在线粒体膜上，诱发细胞色素C自线粒体的释放，诱导细胞的凋亡。本研究结果显示经过模型制备的小鼠PI3K、p-AKT、Bcl-2水平明显下降，Bax浓度上调，经过松花粉总黄酮干预后大鼠上述指标表达明显改善。

总之，松花粉总黄酮可明显逆转化学性肝损伤病理，其作用机制可能与抑制肝脏细胞凋亡，而该过程可能是通过PI3K/AKT信号通路介导的。

参考文献

[1]王善龙，李三强，张勇勇，等.不同性别小鼠急性化学性肝损伤中小RNA的比较分析[J].河南科技大学学报：医学版，2018，36（3）：161-164.

[2]凌顺.促肝细胞生长素对急性化学性肝损伤大鼠的保护作用研究[D].桂林：桂林医院，2017.

[3]何国鑫，邓青芳，陈华国，等.杠板归乙醇提取物对化学性肝损伤小鼠的保护作用[J].中成药，2019，41（6）：1253-1257.

[4]赵麟萱，高卓林，王莹，等.保肝软胶囊对化学性肝损伤的辅助保护作用[J].特产研究，2019，41（2）：62-65.

[5]杨原芳，林良才，蔡海荣，等.电温针法治疗急性期风寒型周围性面瘫的临床疗效观察[J].浙江中医药大学学报，2017，41（9）：775-778.

[6]刘瑞芳，赵华，李建华，等.益生菌酸奶对机体血脂水平影响的Meta分析[J].中国全科医学，2016，19（32）：3973-3978.

[7]贺国芳，丁伊玲，徐清霞，等.白芨多糖预防免疫及化学性肝损伤[J].医药导报，2016，35（7）：714-717.

[8]刘丽，李军，訾慧，等.保肝颗粒对小鼠急性化学性肝损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（20）：123-126.

[9]刘芬.白芍总苷对急性化学性肝损伤小鼠的保护作用研究[J].中药药理与临床，2015，31（4）：100-102.

[10]刘协，张驰，包六行，等.松花粉对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究[J].江苏预防医学，2005，16（2）：7-9.

[11]谢惠萍，陈琼瑶，蒋中仁，等.松花粉对酒精性肝损伤的保护功能研究[J].中国现代医药杂志，2008，10（4）：47-49.

[12]Wang W，Xiao Y，Li S，et al.Synergistic activity of magnolin combined with B-RAF inhibitor SB590885 in hepatocellular carcinoma cells via targeting PI3K-AKT/mTOR and ERK MAPK pathway[J].Am J Transl Res，2019，11（6）：3816-3824.

[13]黄秀昆.老鼠簕生物碱A对肝纤维化大鼠PI3K/Akt和NF-kB信号通路的影响[D].南宁：广西医科大学，2019.

[14]谷雪，付文娟，孙芳初，等.PI3K/Akt信号通路与放射性肝损伤的关系研究[J].解放军预防医学杂志，2018，36（12）：1581-1584.

[15]翁丹丹，王俊波，郦光晓.PI3K/AKT/mTOR信号通路对甘氨鹅脱氧胆酸钠诱导的肝细胞凋亡的机制研究[J].中国临床药理学与治疗学，2019，24（2）：121-127.

[16]丁蔚，毛倩.虫草素通过PI3K/Akt/mTOR通路对亚硝基二乙基胺誘导的肝细胞癌的防护作用[J].中国药师，2019，22（4）：605-608.

[17]吴灿，黄亮，莫立乾，等.丹参多酚酸盐通过TGF-β1/Smad和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制[J].中国医院药学杂志，2019，39（7）：670-675.

[18]方惠娴.四逆散加味方对免疫诱导肝纤维化大鼠肝组织NOX、PI3K/Akt信号通路的影响[D].兰州：甘肃中医药大学，2018.

（2019-08-30收稿 责任编辑：徐颖）